為了進(jìn)一步研究MAO-A是否作為巨噬細(xì)胞自主因子直接調(diào)控TAM極化從而影響抗**免疫，進(jìn)行了巨噬細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移**實驗。從Maoa WT和KO小鼠中獲取BM細(xì)胞，然后培養(yǎng)成骨髓源性巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophages, BMDMs)。然后將這些Maoa WT或KO BMDMs與B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞混合，皮下注射到BoyJ WT受體小鼠中建立實體**（圖2g）。在本實驗中，MAO-A缺乏的比較***于TAM細(xì)胞。在接受Maoa KO BMDMs小鼠中觀察到**生長抑制（圖2h-i），TAM免疫抑制markers下調(diào)（圖2j），免疫刺激markers上調(diào)（圖2k-l），以及增強(qiáng)**浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞***（圖2m）。綜上所述，這些體內(nèi)研究表明MAO-A作為一種直接調(diào)節(jié)TAM極化的自主因子，從而影響T細(xì)胞抗**反應(yīng)性和影響**生長。
接下來，在低氧條件下，在HCCLM3和Hep3B細(xì)胞中敲低CFL1的表達(dá)（圖5A）。結(jié)果表明，CFL1敲除***逆轉(zhuǎn)了缺氧誘導(dǎo)的HCCLM3細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲以及EMT（圖5A-D）。綜上所述，這些結(jié)果表明CFL1表達(dá)受HIF-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的HCC進(jìn)展。
6、CFL1通過抑制泛素介導(dǎo)的PLD1降解來維持PLD1的表達(dá)為了進(jìn)一步探索CFL1在HCC中致*作用的下游機(jī)制，利用KEGG數(shù)據(jù)庫篩選了受CFL1影響的通路。其中CFL1的高表達(dá)與細(xì)胞膜中細(xì)胞粘附分子和蛋白的定位密切相關(guān)（圖6A）。然后，基于蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫預(yù)測了CFL1和PLD1之間的潛在相互作用（圖6B）。CFL1敲低降低了HCCLM3細(xì)胞中PLD1的蛋白水平，而CFL1過表達(dá)增強(qiáng)了Hep3B細(xì)胞中PLD1蛋白表達(dá)（圖6C）。co-IP實驗表明，CFL1與PLD1相互作用，敲低CFL1可促進(jìn)肝*細(xì)胞中PLD1的泛素化(圖6D-E)。用放線菌酮(CHX，2μg/mL)阻斷肝*細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。繪制蛋白降解曲線，表明CFL1敲低時PLD1蛋白降解更快（圖6F）。此外，蛋白酶體抑制劑MG132(25μM)處理可阻斷CFL1敲低誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞中PLD1降解（圖6F）。因此，這些結(jié)果表明CFL1抑制肝*細(xì)胞中泛素介導(dǎo)的PLD1蛋白水解。 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 課題產(chǎn)學(xué)研合作表達(dá)PTEN- 398A的細(xì)胞中上調(diào)的基因與G1/S檢查點的***有關(guān)。
結(jié)果1）AKI伴有明顯的脂質(zhì)積累，并與腎損傷的嚴(yán)重程度高度正相關(guān)
根據(jù)脂質(zhì)代謝組學(xué)分析結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)AKI組織中各類甘油三酯(TGs)含量***增加(圖1A)?？紤]到AKI中的脂質(zhì)積累，我們進(jìn)行實驗來確定其臨床意義。我們對不同嚴(yán)重程度的AKI動物標(biāo)本進(jìn)行油紅O染色。結(jié)果顯示，隨著疾病進(jìn)展的延長，小鼠腎組織脂質(zhì)沉積逐漸增加(圖1B)。在體外也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，即隨著細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度，脂質(zhì)積累的程度增加(圖1C)。這些結(jié)果說明AKI中的脂質(zhì)積累與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。
VDR***STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠AMPK.
為了進(jìn)一步證實VD-VDR對高糖環(huán)境下AMPK***的影響，我們檢測了STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠AMPK-ULK1的磷酸化水平。如圖8所示，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠PRKAA1和ULK1磷酸化水平降低，KO+STZ小鼠的這種變化更明顯。此外，paricalcitol或VDR過表達(dá)促進(jìn)PRKAA1和ULK1磷酸化，盡管WT+STZ組和OE+STZ組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。我們還通過免疫熒光染色檢測了p-PRKAA1的水平，其變化趨勢與蛋白印跡相似。結(jié)合圖3E的結(jié)果，我們推測在STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎臟中，VDR需要VD***才能有效磷酸化PRKAA1，然后調(diào)節(jié)自噬。綜上所述，VD-VDR通過***AMPK-ULK1通路恢復(fù)了stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟缺陷的自噬。 可以上傳原始的fast文件。
二、阻斷atm依賴的PTEN磷酸化導(dǎo)致基因組
了確定ATM介導(dǎo)的PTEN磷酸化如何調(diào)節(jié)DDR，構(gòu)建Pten398A/398A和Pten+/+littermatesMEFs細(xì)胞模型。PTEN蛋白水平不受398A突變的影響(補(bǔ)充圖3A,B)。此外，磷酸化AKT(PI3K通路活性的標(biāo)記物)水平在Pten398A/398A和PTEN+/+MEFs中相似(補(bǔ)充圖3B)。構(gòu)建人乳腺上皮細(xì)胞系(MCF10A)，穩(wěn)定表達(dá)野生型PTEN(PTEN-wt)，或PTEN的突變形式，不能被ATM磷酸化(PTEN-398a)。在這些細(xì)胞中，內(nèi)源性的PTEN基因被CRISPR/Cas9編輯刪除，創(chuàng)建了PTEN空細(xì)胞，然后用野生型或突變型的蛋白質(zhì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)重組。在表達(dá)PTEN-wt和PTEN-398a的MCF10A細(xì)胞中，PTEN蛋白和磷酸化AKT水平相似(補(bǔ)充圖3A)，使這些細(xì)胞成為ATM磷酸化PTEN分子作用研究的合適替代模型。Pten+/+和Pten398A/398Amef在10gyIR作用下，通過測定每個細(xì)胞的γH2AX和53bp1病灶數(shù)量來評估其修復(fù)DNA損傷的能力。在Pten+/+mef中，我們觀察到在照射后4小時，每個細(xì)胞的病灶數(shù)量達(dá)到峰值，24小時后恢復(fù)到接近基線水平(圖2AC)。Pten+/+和Pten398A/398A在ir后4小時，每個細(xì)胞聚集的病灶數(shù)量相似。然而，Pten398A/398Amef在24小時時間點比Pten+/+mef保留了更多的病灶數(shù)，表明DNA修復(fù)能力降低(圖2C)。 產(chǎn)生關(guān)于環(huán)境影響疾病的病因和分子機(jī)制的可測試的假設(shè)。非酒精性脂肪性肝炎課題分子生物學(xué)
我們接下來研究了Pex對HSCs生物學(xué)行為的影響。凋亡課題課題設(shè)計
鑒于以上結(jié)果，作者想進(jìn)一步探究tiRNA-Gly與RBM17作用的分子結(jié)果。結(jié)果顯示，tiRNA-Gly可提高總RBM17蛋白的水平，但是不影響RBM17的mRNA水平（圖3H-I）。隨后，用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己胺(CHX)處理細(xì)胞，tiRNA-Gly轉(zhuǎn)染后增加了K1細(xì)胞內(nèi)源性RBM17蛋白的半衰期，而β-actin作為對照（圖3J）。此外，蛋白酶體抑制劑MG132處理后，內(nèi)源性RBM17在轉(zhuǎn)染tiRNA-Gly的K1細(xì)胞中的積累量**高于轉(zhuǎn)染siRNA-NC的K1細(xì)胞，表明tiRNA-Gly抑制了蛋白酶體依賴性的PTC細(xì)胞中RBM17的降解（圖3K）。此外，tiRNA-Gly的過表達(dá)***抑制了泛素化RBM17的水平（圖3L）。綜上所述，tiRNA-Gly可以穩(wěn)定RBM17蛋白通過泛素/蛋白酶體依賴性降解。凋亡課題課題設(shè)計
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