三、pten-s38a突變誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抵抗
為了進(jìn)一步了解阻斷atm依賴的PTEN磷酸化如何影響細(xì)胞對(duì)基因毒性損傷的反應(yīng)，我們使用抗體陣列評(píng)估了表達(dá)PTEN-wt或PTEN-398a的MCF10A細(xì)胞裂解液的應(yīng)激反應(yīng)和凋亡通路的活性。Pten+/+和Pten398A/398AMEF培養(yǎng)，表達(dá)Pten-wt的MCF10A細(xì)胞與表達(dá)Pten-398A的MCF10A細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生長速率均無差異(圖3A和補(bǔ)充圖5C)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同的基因毒性脅迫處理:IR、順鉑和柔紅霉素。在所有條件下，Pten398A/398AMEFs和PTEN-398A表達(dá)的MCF10A細(xì)胞對(duì)基因毒性脅迫的抗性均高于野生型PTEN的細(xì)胞(圖3BD和SupplementaryFig.5D,E)。通過流式細(xì)胞儀AnnexinV染色判斷(圖3E)。通過使用caspase-3抗體對(duì)Pten+/+、MMTVneu和Pten398A/398A、MMTVneu**進(jìn)行免疫組化染色，證實(shí)了這些觀察結(jié)果。 高通量測(cè)序后續(xù)的機(jī)制實(shí)驗(yàn)。醫(yī)學(xué)科研課題
作者進(jìn)行了PAR-CLIP實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估SLC7A11 mRNA-YTHDC2相互作用是否依賴于m6A甲基化。結(jié)果表明，在H1299細(xì)胞中，通過過表達(dá)METTL3來提高m6A的甲基化水平，促進(jìn)YTHDC2與SLC7A11 mRNA的結(jié)合(圖6D)。無論METTL3是否過表達(dá)，YTH結(jié)構(gòu)域的缺失都阻斷了SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用(圖6D)。作者通過SLC7A11 3’-UTR探針進(jìn)行RNA-pull down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)YTHDC2WT，優(yōu)先結(jié)合于含有m6A的SLC7A11 mRNA的3'UTR，而不是含有未甲基化腺苷的mRNA(圖6E)。此外，YTHDC2傾向于結(jié)合m6A共識(shí)基元GGAC (圖6E)。通過在H1299和H1975細(xì)胞中進(jìn)行METTL3的功能增加和丟失實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用是由m6A水平?jīng)Q定的(圖6F和G)。這些數(shù)據(jù)表明YTHDC2優(yōu)先與m6A甲基化的SLC7A11 mRNA結(jié)合。代謝組學(xué)課題整包服務(wù)根客戶的研究方向查閱相關(guān)文獻(xiàn)。
核仁小RNA(snoRNAs)是一類存在于真核生物細(xì)胞核仁的小分子非編碼RNA，長度60-300nt，能與核仁核糖**白結(jié)合形成snoRNPs復(fù)合物[1]。在脊椎動(dòng)物中編碼核仁小RNA的基因主要存在于蛋白編碼基因或非蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域，并且經(jīng)過進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄后加工處理形成成熟的核仁小RNA[2]。具有保守的結(jié)構(gòu)元件，按結(jié)構(gòu)可以分為三類：boxC/DsnoRNA、boxH/ACAsnoRNA和MRPRNA（研究較少）。在核糖體RNA的加工過程中，前兩類snoRNAs分別發(fā)揮兩種修飾作用：核糖體RNA的2-O–甲基化和假尿嘧啶化[3]。絕大多數(shù)snoRNA的宿主基因編碼的蛋白或者轉(zhuǎn)錄本為核糖體的生物合成與功能所必須，且作為5′末端寡嘧啶家族參與生長依賴的翻譯調(diào)控。snoRNAs參與的生物學(xué)過程主要有rRNA的加工處理，RNA剪接和翻譯過程的調(diào)控以及氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]。由于snoRNA被認(rèn)為主要存在于核仁能單一，之后的很長一段時(shí)間，snoRNA的研究陷入低潮。然而，近幾年，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的數(shù)據(jù)表明snoRNA在**中被異常調(diào)控，還參與到遺傳性疾病、造血、代謝以及*癥的過程中。
OARSI分級(jí)(圖6E)進(jìn)一步提示小鼠SHAM+載體和DMM+circPde4b組軟骨降解較少，而DMM+載體和DMM+circPde4b+RIC8A組軟骨降解情況相反。熱板試驗(yàn)、膝關(guān)節(jié)伸展試驗(yàn)和電擊刺激跑步機(jī)試驗(yàn)顯示，DMM+載體組和DMM+circPde4b+RIC8A組的不適和膝關(guān)節(jié)疼痛多于SHAM+載體組和DMM+circPde4b組(圖6F)。小鼠膝關(guān)節(jié)的三維微CT重建顯示，DMM+NC組和DMM+circPde4b+RIC8A組比SHAM+載體和DMM+circPde4b組有更多的骨贅(圖6G)。此外，四組中RIC8A和p-p38標(biāo)記的免疫組化染色顯示過表達(dá)circPde4b下調(diào)了RIC8A和p-p38的表達(dá)，從而抑制了DMM手術(shù)引起的OA進(jìn)展(圖6H，I)。綜上所述，在小鼠中，circPde4b和RIC8A參與了OA的發(fā)病機(jī)制（圖6J）。
結(jié)論：我們的研究描述了一種新的circRNA在OA中的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)circPDE4B可以作為蛋白質(zhì)降解的支架，在OA的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。在臨床前動(dòng)物模型中，CircPDE4B被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝，阻止軟骨基質(zhì)的形成，證實(shí)了其對(duì)OA發(fā)生的潛在***作用。機(jī)制上，circPDE4B可作為促進(jìn)RIC8A-MID1結(jié)合的支架，降低RIC8A依賴的p38信號(hào)通路的***，從而調(diào)節(jié)OA的進(jìn)展。 可以推斷基因調(diào)控事件之間的關(guān)系。
6）DRD2通過下調(diào)DDX5和eEF1A2來抑制NF-κB通路的***和**的發(fā)生DRD2異位表達(dá)***抑制了p65和NF-κB靶基因IL-10的mRNA表達(dá)(圖6A)，表明在沒有配體***的情況下，DRD2是NF-κB通路的負(fù)調(diào)控因子。除了結(jié)合***β-arrestin2外，DRD2還可能通過其他方式抑制NF-κB信號(hào)通路。采用Co-IP法分離可能的結(jié)合蛋白，并采用質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白鑒定。MDA-MB231和BT549細(xì)胞的所有結(jié)合蛋白中，DDX5、eEF1A2和ICAM-1均被異位表達(dá)的DRD2下調(diào)(圖6B-C)。根據(jù)以往的研究，DDX5和eEF1A2是幾種**中的兩種致*基因。WB也證實(shí)了DDX5和eEF1A2蛋白水平下調(diào)(圖6D)。在293T和MDA-MB231中，通過Co-IP和IB實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DRD2、DDX5和eEF1A2的結(jié)合(圖6E)，表明這三種蛋白形成了一個(gè)復(fù)合物。完善的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)提供可視化的建模服務(wù)。FISH課題協(xié)同創(chuàng)作
醫(yī)學(xué)整體課題外包服務(wù)。醫(yī)學(xué)科研課題
顯微圖像補(bǔ)充了流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，顯示在來IFN-High的SLE的CD8+ T細(xì)胞中，線粒體在形態(tài)上與IFN -Neg的SLE患者不同，在IFN-High CD8+ T細(xì)胞中，每個(gè)細(xì)胞的平均線粒體總體積更大(圖2e)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在SLE患者中，長期暴露IFNα可能會(huì)觸發(fā)CD8+細(xì)胞的線粒體變化，但不會(huì)觸發(fā)CD4+和T細(xì)胞的線粒體變化，這可能導(dǎo)致代謝紊亂的細(xì)胞，對(duì)其功能具有潛在的影響。
3、來自IFN-High的SLE患者的CD8+T細(xì)胞的SRC減少
接下來比較了從SLE患者和HC外周血分選的離體CD4+和CD8+T細(xì)胞的線粒體呼吸和有氧糖酵解。使用Seahorse細(xì)胞外通量分析儀，發(fā)現(xiàn)IFN-Neg患者的CD8+T細(xì)胞具有與HC相似的基礎(chǔ)和比較大耗氧量率(OCR)，而IFN-High患者的CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出較少的基礎(chǔ)和比較大OCR（圖3a）。 醫(yī)學(xué)科研課題
公司特色是以各式高通量二代測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，利用生物數(shù)據(jù)信息分析手段，通過英拜生物自有的分子、病理以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，提供課題整體設(shè)計(jì)外包、撰寫SCI論文一站式服務(wù)。公司實(shí)驗(yàn)平臺(tái)落座在漕河涇開發(fā)區(qū)浦江園區(qū)，實(shí)驗(yàn)平臺(tái)開放參觀，客戶可隨時(shí)參觀實(shí)驗(yàn)并參與實(shí)驗(yàn)課題的進(jìn)度，保證您的實(shí)驗(yàn)是在您的指導(dǎo)下完成。
1.整體課題外包服務(wù)：RNA甲基化研究專題，外泌體研究專題，wnt/VEGF/toll等經(jīng)典通路研究，設(shè)計(jì)的課題均具有后續(xù)實(shí)驗(yàn)課題的延展性，為您的標(biāo)書奠定較好的基礎(chǔ)
2.標(biāo)書申請(qǐng)：提供標(biāo)書課題設(shè)計(jì)、撰寫，標(biāo)書部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的開展，設(shè)計(jì)的標(biāo)書均符合科研前沿?zé)狳c(diǎn)，中標(biāo)率很高。
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4.二代測(cè)序：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、smallRNA測(cè)序、snoRNA測(cè)序、TRF測(cè)序
5.芯片：信號(hào)通路pcr芯片蛋白芯片
6.表觀遺傳實(shí)驗(yàn)：DNA甲基化實(shí)驗(yàn)（BSP,MSP，焦磷酸測(cè)序），RNA甲基化實(shí)驗(yàn)
7.實(shí)時(shí)定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(靶基因驗(yàn)證，過表達(dá)，干擾),基因突變及SNP檢測(cè)，F(xiàn)ISH，RNA-PULLdown，rip，chip實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞增殖，凋亡，流式等細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)