我們接下來試圖識(shí)別circPDE4B上游調(diào)節(jié)器。我們首先對(duì)circPDE4B側(cè)翼序列進(jìn)行RNA pull-down-MS檢測，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與RNA剪接相關(guān)的RBP，包括DExH-box helicase 9和FUS(圖1G)。RT-qPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)US敲除后，HCs中circPDE4B表達(dá)下調(diào)，而pPDE4B和mPDE4B沒有明顯變化(圖1H)。此外，***兩種FUS shRNA慢病毒只降低了circPDE4B的表達(dá)(圖1I)，而過表達(dá)FUS則上調(diào)了circPDE4B的表達(dá)(圖1I)。接下來，RIP分析顯示FUS與外顯子相鄰的位點(diǎn)結(jié)合，而其他遠(yuǎn)端位點(diǎn)則可以忽略(圖1J，K)。我們還尋找了可能的FUS響應(yīng)元素，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)可能的motifs，A位于上游，B位于下游。我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)了兩個(gè)短的circPDE4B微基因，包括circPDE4B-s和circPDE4B-s-del(圖1L)。RIP顯示FUS與circPDE4B-s之間存在明顯的相互作用，但與circPDE4B-s-del之間沒有相互作用(圖1M)，表明FUS需要周圍內(nèi)含子中的假定位點(diǎn)來結(jié)合。我們接下來在表達(dá)circPDE4B-s/del的HCs中敲除FUS，發(fā)現(xiàn)與circPDE4B-del相比，circPDE4B-s***減少了FUS敲除的circPDE4B轉(zhuǎn)錄本(圖1N)。值得注意的是，在HCs中FUS被TNF-α下調(diào)(圖1O)。綜上所述，在OA中circPDE4B的下調(diào)至少部分是由FUS的抑制引起的。為鑒定IGF2BPs泛素化的E3連接酶對(duì)RNA下拉沉淀物進(jìn)行質(zhì)譜分析。RNA PULLdown標(biāo)書廣東
2）Pex增強(qiáng)肝衛(wèi)星細(xì)胞(HSCs)的活性
為了證實(shí)Pex的生物學(xué)功能，將原代小鼠肝細(xì)胞與Pex孵育，Pex被受體細(xì)胞吸收。然后使用免疫熒光染色對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞的類型進(jìn)行表征，結(jié)果顯示，desmin+HSCs和F4/80+Kupffer細(xì)胞吸收了Pex(圖2A)。我們接下來研究了Pex對(duì)HSCs生物學(xué)行為的影響，發(fā)現(xiàn)Pex***增強(qiáng)了HSCs的增殖和遷移能力(圖2B和C)。Pex與Npex處理的HSCs的凋亡沒有***差異(圖2D)。westernblot和免疫熒光檢測結(jié)果顯示，Pex***上調(diào)α-SMA的表達(dá)，說明Pex能促進(jìn)HSC的活化(圖2E和F)。我們觀察到Pex可以通過下調(diào)vitronectin和tenascinC的表達(dá)，上調(diào)collagenI和fibronectin的表達(dá)來調(diào)節(jié)HSCs中的ECM分泌(圖2G)。 RNA PULLdown標(biāo)書廣東circSDHC在ccRCC中過表達(dá)且其過表達(dá)與低存活率相關(guān).
六、THDF1通過FZD7調(diào)控Wnt/b-catenin通路
A，典型Wnt/b-catenin通路示意圖。B, YTHDF1敲低或過表達(dá)MGC-803和HGC-27細(xì)胞中總(B -catenin)和非磷酸化(Ser33/37/Thr41, activated B -catenin) B -catenin的蛋白水平。C, IF染色分析YTHDF1敲低、過表達(dá)或突變過表達(dá)的MGC-803和HGC-27細(xì)胞中總(紅色)和***的(綠色) b-catenin的亞細(xì)胞定位。D，免疫印跡分析b-catenin靶基因、HMGA2、cyclin D、CDC25A、COX2、SOX9、VEGFA在YTHDF1敲低、過表達(dá)或突變過表達(dá)MGC-803和HGC-27細(xì)胞中的表達(dá)。E，定量分析YTHDF1敲低和過表達(dá)MGC- 803和HGC-27細(xì)胞中b-catenin靶基因的RNA水平(n =3)。
tiRNA-Gly直接與RBM17相互作用，調(diào)控RBM17在PTC細(xì)胞中的表達(dá)
為了探究tiRNA-Gly在促*中分子機(jī)制，作者合成了生物素標(biāo)記的tiRNA-Gly及其反義序列，進(jìn)行RNApull-down實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而挖掘K1細(xì)胞中與tiRNA-Gly相互作用的蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)50KD左右大小的條帶，選擇經(jīng)質(zhì)譜測定肽數(shù)>3和獨(dú)特肽數(shù)>3的蛋白，獲得了5個(gè)可能的tiRNA-Gly相互作用蛋白，其中RBN17通過了WB驗(yàn)證（圖2B）。RIP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)tiRNA-Gly在RBM17抗體組富集（圖3C）。進(jìn)一步RIP實(shí)驗(yàn)表明，tiRNA-Gly在RBM17全長序列中***富集，但在UHM截?cái)嗪蟮男蛄兄懈患?**下降，表明tiRNA-Gly和RBM17的相互作用依賴UHM（圖3D）。此外，與tiRNA-Gly的相互作用促進(jìn)了K1細(xì)胞RBM17從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，雖然tiRNA-Gly主要定位于細(xì)胞質(zhì)，但同時(shí)導(dǎo)致K1細(xì)胞胞質(zhì)RBM17蛋白水平降低，核RBM17蛋白水平升高（圖3E-G）。因此，這些研究表明tiRNA-Gly與RBM17的UHM結(jié)合促進(jìn)RBM17的核轉(zhuǎn)運(yùn)。 第4周測定FITC標(biāo)記的葡聚糖(4kd)和血液中FITC水平。
對(duì)離體培養(yǎng)的Maoa野生型和KOBMMDs中ROS水平的測定也顯示，在IL-4/IL-13刺激或不刺激下，MaoaKOBMMDs中ROS水平降低，與體內(nèi)TAM結(jié)果一致（圖4d）。向IL-4/IL-13刺激的MaoaWT和KOBMDMs補(bǔ)充H2O2可將其細(xì)胞內(nèi)ROS水平提高到相似水平，并消除它們?cè)诿庖咭种茦?biāo)記物和特征基因表達(dá)的差異（圖4e-g）。另一方面，補(bǔ)充酪氨酸(MAO-A的底物)可增加ROS水平，并上調(diào)免疫抑制基因在MaoaWTBMDMs中的表達(dá)，但在MaoaKOBMDMs中不上調(diào)（圖4h-j）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明MAO-A通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫抑制極化。circNDUFB2作為一個(gè)支架增強(qiáng)IGF2BP蛋白與TRIM25的結(jié)合。RNA PULLdown標(biāo)書廣東
生物素標(biāo)記的miR-127-3p比陰性對(duì)照探針捕獲的circSDHC.RNA PULLdown標(biāo)書廣東
我們已經(jīng)進(jìn)行了snATAC-seq和snRNA-seq來研究染色質(zhì)可及性如何改善我們對(duì)成熟人類腎臟中細(xì)胞狀態(tài)和功能的理解。我們生成了一個(gè)包含轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組數(shù)據(jù)的交互式多模態(tài)圖譜。結(jié)合snRNA-seq和snATAC-seq分析提高了檢測近端小管和厚升肢內(nèi)獨(dú)特細(xì)胞狀態(tài)的能力，并重新定義了可能有助于腎臟再生和細(xì)胞特異性離子通透性的細(xì)胞異質(zhì)性。
一、人類成年腎臟的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)可及性分析
1）成人腎臟中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)可及性分析
snRNA-seq基于譜系特異性標(biāo)記的表達(dá)(圖1c，補(bǔ)充圖1b)，鑒定了腎皮質(zhì)內(nèi)所有主要細(xì)胞類型(圖1b，補(bǔ)充圖1a)。檢測了近端小管(PT)、壁上皮細(xì)胞(PEC)、粗升肢(TAL)、遠(yuǎn)端小管(DCT1、DCT2)、連接小管(CNT)、**管(PC、ICA、ICB)、內(nèi)皮細(xì)胞(ENDO)、腎小球細(xì)胞類型(MES、PODO)、成纖維細(xì)胞(FIB)和少量白細(xì)胞(LEUK)(補(bǔ)充表2、補(bǔ)充數(shù)據(jù)1)。值得注意的是，近端小管亞群中VCAM1表達(dá)增加(PT_VCAM1)。該亞群還表達(dá)了HAVCR1，這是一種急性損傷后近端小管上調(diào)的基因，是長期腎臟預(yù)后的預(yù)測因子。 RNA PULLdown標(biāo)書廣東
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4.二代測序：轉(zhuǎn)錄組測序、smallRNA測序、snoRNA測序、TRF測序
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