研究了方法差異對(duì)下游生物學(xué)分析的影響A.B.去除中性粒細(xì)胞**提高了在細(xì)胞核和細(xì)胞的均勻流形近似和投影(UMAP)投影中分離各種細(xì)胞類型的能力.C使用這些工具，中性粒細(xì)胞的去除提高了標(biāo)記轉(zhuǎn)移評(píng)分，與核基方法相比，滲透性細(xì)胞產(chǎn)生了更多具有高標(biāo)記轉(zhuǎn)移評(píng)分的細(xì)胞.D所有方法產(chǎn)生的CD16+單核細(xì)胞均少于流式細(xì)胞術(shù)觀察到的CD16+單核細(xì)胞，這表明無論是使用核或通透細(xì)胞的scATAC-seq過程中，CD16+單核細(xì)胞可能丟失，或者標(biāo)簽轉(zhuǎn)移方法不利于識(shí)別這種細(xì)胞類型.CircRNA在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的行為和機(jī)制尚未見報(bào)道.蛋白組學(xué)標(biāo)書實(shí)驗(yàn)外包
4、外泌體miR-138-5p通過抑制KDM6B表達(dá)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化
隨后，作者研究了在不同培養(yǎng)條件下TPH-1的表達(dá)譜。首先，和**細(xì)胞共培養(yǎng)抑制了M1相關(guān)基因的表達(dá)，IL-6，TNF-α，和IL-1β，但是增加了M2相關(guān)基因的表達(dá)CD163，Arg-1，IL-10,TGF-β和VEGFA。過表達(dá)KDM6B部分抑制了上述表現(xiàn)改變（圖4A-B）。流式檢測(cè)顯示乳腺*細(xì)胞和TPH-1的共培養(yǎng)增加了CD163陽性細(xì)胞數(shù)比例，但是過表達(dá)KDM6N可以抑制這種效果（圖6C）。類似的，過表達(dá)KDM6B抑制了miR-138-5p誘導(dǎo)的M2極化（圖4D-F）。與對(duì)照組相比，乳腺*來源的外泌體miR-138-5p降低了M1相關(guān)表型，相反，M2標(biāo)志物增加并伴隨著CD163陽性細(xì)胞數(shù)的增加（圖6G-I）。用從乳腺*細(xì)胞中分離出來的外泌體處理THP-1細(xì)胞導(dǎo)致了M2極化，抑制miR-138-5p的表達(dá)可挽救這種極化（圖4J-L）?？傊?，這些結(jié)果表明外泌體miR-138-5p通過抑制KDM6B表達(dá)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化。 單細(xì)胞相關(guān)課題標(biāo)書實(shí)驗(yàn)外包LAG抗體***富集ciRS-7但未富集circNDUFB2.
4、miR-208b直接靶向和抑制CD4+T細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)
為了進(jìn)一步探究miR-208b的分子機(jī)制，探究了其下游靶基因機(jī)制，使用生信預(yù)測(cè)了其靶基因，**終挑選到PDCD4（圖5A）。熒光素酶進(jìn)一步證實(shí)了miR-208b和PDCD4之間的結(jié)合（圖5C-D）。研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)在SW480外泌體處理組***下降，而這個(gè)抑制作用在SW480-OXA組更加明顯，PCD表達(dá)在miR-208b缺失組則***升高（圖5E）。此外，加入miR-208bmimics后，PDCD4蛋白***降低，而抑制miR-208b后，PDCD4蛋白的表達(dá)相對(duì)增強(qiáng),此外，PDCD4在mRNA水平的表達(dá)沒有明顯變化（圖5F）。然后，評(píng)估了miR-208b對(duì)CD4+T細(xì)胞擴(kuò)增的影響。研究表明，轉(zhuǎn)染miR-208bmimics***增強(qiáng)了Treg的擴(kuò)增，而抑制miR-208b水平則抑制了Treg的擴(kuò)增（圖5G-H）。這些結(jié)果表明miR-208b直接靶向抑制PDCD4的表達(dá)，導(dǎo)致Treg分化。
2、CFL1的高表達(dá)與HCC的不良預(yù)后相關(guān)單變量分析顯示，**大小、**數(shù)量、TNM分期、靜脈浸潤、HBV***和CFL1水平與HCC患者的總體生存率***相關(guān)（表2）。多變量分析顯示，***大小、**數(shù)量、靜脈浸潤和CFL1水平是HCC總體生存率的**預(yù)后指標(biāo)（表2）。并且，可以看出CFL1的高表達(dá)與HCC的不良預(yù)后相關(guān)。
3、CFL1促進(jìn)HCC的增殖，遷移和侵襲如圖2所示，在高表達(dá)CFL1的HCCLM3和MHCC97h細(xì)胞中，敲除CFL1(圖2A)。隨后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除CFL1后HCCLM3和MHCC97h細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力被抑制，表明CFL1促進(jìn)HCC的增殖，遷移和侵襲。 circNDUFB2過表達(dá)影響934個(gè)基因的表達(dá)水平。
5、KDM6B去甲基化酶活性增加了M1相關(guān)基因的表達(dá)
抑制KDM6B的組蛋白去甲基化酶活性可抑制其靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此，使用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)來分析M1靶基因的啟動(dòng)子活性。KDM6B的過表達(dá)特異性地刺激了促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α編碼基因的啟動(dòng)子活性（圖5A）。相反，沉默KDM6B活性則導(dǎo)致他們的啟動(dòng)子活性抑制，而過表達(dá)KDM6B降低了H3K27me3的水平（圖5B）。ChIP檢測(cè)顯示，與對(duì)照相比，THP-1細(xì)胞中KDM6B的過表達(dá)或敲除***增加或減少了KDM6B啟動(dòng)子在不同區(qū)域的占用(圖5C-D)。與此結(jié)果一致，啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3的募**降低或增加當(dāng)KDM6B過表達(dá)或沉默時(shí)（圖5E-F）?？傊抡{(diào)KDM6B可提高H3K27me3水平和促炎因子編碼基因的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致抑制M1極化。 說明DHEA***對(duì)血清代謝有深遠(yuǎn)的影響.河北標(biāo)書分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
circSDHC在ccRCC中過表達(dá)且其過表達(dá)與低存活率相關(guān).蛋白組學(xué)標(biāo)書實(shí)驗(yàn)外包
6、**來源外泌體miR-208b影響體內(nèi)化療效果和**生長
隨后作者探究了**來源外泌體miR-208b體內(nèi)對(duì)化療效果和**生長的影響。用慢病毒轉(zhuǎn)染CT26細(xì)胞產(chǎn)生miR-208b過表達(dá)和miR-208b敲低細(xì)胞系。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖如圖7A所示，實(shí)驗(yàn)采用6組(每組10只小鼠)，其中3組使用奧沙利鉑，BALB/c小鼠植入CT26細(xì)胞，建立**植入模型。如圖7B-7D所示，miR-208b-OE組**生長速度較快，而中miR-208-KD組**生長明顯慢于對(duì)照組。從各組小鼠中分離出外周血CD4+T細(xì)胞，結(jié)果顯示miR-208b-OE組中PDCD4的***下調(diào)，miR-208-KD組的結(jié)果則相反(圖7E和7F)。然而，在PDCD4mRNA水平上沒有觀察到差異(圖7G)。從血清中分離出外泌體，檢測(cè)miR-208b水平(圖7H)。如預(yù)期的，miR-208b在miR-208b-OE組中***升高，而miR-208b-KD組中miR-208b水平下降(圖7I)。這些結(jié)果表明，**分泌的miR-208b在體內(nèi)可以充分地傳遞到CD4+T細(xì)胞中，抑制PDCD4的表達(dá)。此外，這種現(xiàn)象在奧沙利鉑***組更加***(miR-208b-OE+OXA和miR-208b-KD+OXA)。 蛋白組學(xué)標(biāo)書實(shí)驗(yàn)外包
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6.表觀遺傳實(shí)驗(yàn)：DNA甲基化實(shí)驗(yàn)（BSP,MSP，焦磷酸測(cè)序），RNA甲基化實(shí)驗(yàn)
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