六、改進(jìn)分選策略以分離胚胎HSCs/MPPs
研究者基于細(xì)胞表面標(biāo)記設(shè)計(jì)了一種針對(duì)HSCs / MPP的新的熒光***細(xì)胞分選策略（簡(jiǎn)稱CD-REF），使用CD-REF分選板對(duì)股骨BM細(xì)胞進(jìn)行分選，結(jié)果顯示標(biāo)記為HSCs / MPP和HSCs / MPPs-Cycle簇的CD-REF細(xì)胞約占88％。為了評(píng)估CD-REF細(xì)胞譜系輸出的分化潛力和穩(wěn)健性，研究人員在小鼠MS5飼養(yǎng)層或更具生理相關(guān)性的人類胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞（fMSCs）上對(duì)三個(gè)胎兒的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了分選，結(jié)果顯示MS5和fMSCs上分別存在著四系、三系、雙系、單系和未分化的譜系集落。接下來(lái)，又對(duì)單個(gè)CD-REF和免疫表型HSCs進(jìn)行了分類，結(jié)果顯示CD-REF在胎兒肝臟和骨髓中富集了多譜系輸出的細(xì)胞群，且CD-REF細(xì)胞具有與表型HSCs相當(dāng)?shù)亩酀撃苄院妥V系輸出能力，這與前述分化軌跡探究一致，再次驗(yàn)證CD-REF**了高富集的HSC/MPPs群體。 將 CTD 暴露與 CTD 解剖學(xué)相結(jié)合使環(huán)境健康科學(xué)家能夠調(diào)查暴露研究和組織和系統(tǒng)暴露化學(xué)應(yīng)激誘導(dǎo)表型的細(xì)節(jié)。重慶課題一站式
JAK-Stat6信號(hào)通路在介導(dǎo)IL-4/IL-13誘導(dǎo)TME中TAMs免疫抑制極化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。IL-4/IL-13刺激后，JAK磷酸化，隨后Stat6磷酸化，磷酸化后的Stat6二聚并遷移至細(xì)胞核，然后與IL-4/IL-13相應(yīng)基因，包括那些參與巨噬細(xì)胞免疫響應(yīng)功能的基因的啟動(dòng)子結(jié)合。據(jù)報(bào)道ROS可以促進(jìn)JAK和Stat6磷酸化。因此，推測(cè)MAO-A可能通過(guò)上調(diào)ROS水平影響巨噬細(xì)胞極化，從而使JAK-Stat6信號(hào)通路敏感。事實(shí)上，直接分析從B16-OVA荷瘤MaoaWT和MaoaKO小鼠中分離的TAMs證實(shí)，與野生型TAMs相比，MAO-A缺陷的TAMs顯示Stat6***降低（圖4k-l）。進(jìn)一步分析IL-4/IL-13誘導(dǎo)的JAK-Stat6信號(hào)通路，與在MaoaWTBMDMs中相比，在MaoaKOBMDMs中JAK-Stat6信號(hào)***下降，補(bǔ)充H2O2可使其JAK-Stat6信號(hào)達(dá)到與WT類似水平（圖4m）。這些數(shù)據(jù)表明MAO-A通過(guò)ROS致敏的JAK-Stat6通路***促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化。總之，這些體內(nèi)外數(shù)據(jù)支持MAO-A促進(jìn)TME中免疫抑制極化，通過(guò)上調(diào)TAM細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而提高IL-4/IL-13誘導(dǎo)的JAK-Stat6信號(hào)通路。RNA甲基化課題設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)TIMEOR用于推斷基因調(diào)控事件之間的關(guān)系。
4、hnRNPA2B1在外泌體miR-934向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用
據(jù)報(bào)道，外泌體RNA的分泌需要一種特定的RNA結(jié)合蛋白來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)RNApull-down分析和質(zhì)譜分析，鑒定了三種可能參與miR-934轉(zhuǎn)運(yùn)的RNA結(jié)合蛋白，并發(fā)現(xiàn)敲除hnRNPA2B1可以降低外泌體miR-934的表達(dá)（Fig.4a,b）。hnRNPA2B1是一種RNA結(jié)合蛋白，通過(guò)與特定基序GGAG/CCCU結(jié)合，參與miRNAs的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。特別是，由于miR-934序列中有兩個(gè)GGAG基序，我們推測(cè)hnRNPA2B1可能通過(guò)與GGAG序列結(jié)合，介導(dǎo)miR-934包裝成外泌體的過(guò)程。此外，miRNApull-down分析顯示，在細(xì)胞質(zhì)和外泌體中，miR-934和hnRNPA2B1之間存在***的結(jié)合關(guān)系，然而，突變miR-934的結(jié)合序列(GGAG)可削弱這種結(jié)合（Fig.4c）。RNA免疫沉淀分析進(jìn)一步證明，無(wú)論是在CRC細(xì)胞及其外泌體裂解物中，miR-934在anti-hnrnpa2b1抗體組中比在anti-IgG抗體組中更***富集（Fig.4d）。此外，敲除hnRNPA2B1可以抑制外泌體miR-934從HCT8和LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞的過(guò)程（Fig.4e）。因此，這些結(jié)果證實(shí)hnRNPA2B1可以通過(guò)與miR-934的GGAG序列結(jié)合，介導(dǎo)miR-934包裝到CRC細(xì)胞外泌體中，并將外泌體miR-934轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞中。
進(jìn)一步使用E8聚類分析顯示，這些暴露于慢性d-flow的ec向免疫細(xì)胞樣類型(EndICLT)轉(zhuǎn)變，但沒(méi)有達(dá)到完全分化的免疫細(xì)胞狀態(tài)(圖3C和S3)。圖3D顯示了EC簇中EndMT、Tagln、Acta2、Cnn1和Snai1的四個(gè)標(biāo)記物，分別**了s流(E2)、急性d流(E6)和慢性d流(E8)染色質(zhì)可及性的變化。與s-流(E2)和急性d-流(E6)相比，慢性d-流在E8的啟動(dòng)子區(qū)域(箭頭)增加了這些基因的可及性。從scRNA-seq數(shù)據(jù)的小提琴圖中可以看出，E8中相應(yīng)基因的表達(dá)量增加，進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果(圖3E)。ATM對(duì)PTEN的磷酸化導(dǎo)致PTEN在質(zhì)膜上重新分布。
在s-flow條件下，KLF4的TF結(jié)合基元在E2中富集，而NRF1在E3和E4中富集(所有流條件下)(圖6B)。相比之下，暴露于d-flow條件下的E5 E8中，TEF、ETV3、RELA、FOS::JUN、TEAD1和STAT1的TF基序富集(圖6C)。對(duì)一些眾所周知的流量敏感tf的基模的鑒定，KLF4(與KLF2基模相同)，F(xiàn)OS:JUN (AP1)， RELA和TEAD1證實(shí)了我們分析的有效性。為了進(jìn)一步確定新發(fā)現(xiàn)的TF結(jié)合基序是否也與流量依賴反應(yīng)相關(guān)，我們檢測(cè)了phospho -STAT1水平是否對(duì)流量敏感，作為STAT1***的標(biāo)記。pcl術(shù)后2周，與RCA相比，CDH5+ LCA的ECs中phosphoSTAT1水平***升高(圖6D和6E)。有肝轉(zhuǎn)移的PDAC患者外泌體CD44v6和C1QBP的表達(dá)明顯高于無(wú)肝轉(zhuǎn)移的PDAC患者。國(guó)自然課題設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)
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二、npm1突變AML患者聚集的分子基礎(chǔ)
DH2是鈣粘蛋白家族的一員，被認(rèn)為是決定干細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)節(jié)因子15。類似地，G蛋白偶聯(lián)受體12(GPR12)在原始亞型中上調(diào)，已知在干細(xì)胞維持和**干細(xì)胞的體細(xì)胞重編程中發(fā)揮作用。MyoD家族抑制劑(MDFI)在原始亞型中表達(dá)增加，據(jù)報(bào)道它是WNT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因子，只在造血干細(xì)胞祖細(xì)胞中表達(dá)。鋅指蛋白521(ZNF521)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其在人類白血病細(xì)胞系中被敲低可以減少增殖但在原始亞型中卻有***的高表達(dá)。CD163是一種免疫調(diào)節(jié)劑，是巨噬細(xì)胞清清體受體家族的成員，已知在單核細(xì)胞系的AML細(xì)胞中表達(dá)。在committedcluster中其他基因的高表達(dá)包括免疫相關(guān)基因，如C1QA,CD14和MARCO。msl1基因，一種已知的白血病干細(xì)胞增殖抑制因子，也在committedcluster中高表達(dá)。我們通過(guò)qPCR驗(yàn)證了關(guān)鍵基因的差異表達(dá)(圖2B)。使用基因**富集分析(GSEA)，在committed亞型中，免疫反應(yīng)通路如干擾素-γ介導(dǎo)的信號(hào)通路、GPCR信號(hào)通路和toll樣受體(TLR)信號(hào)通路上調(diào)(圖2C,D,SupplementaryFigs.16,18，與FLT3-ITD和DNMT3A突變的弱相關(guān)性一致。 重慶課題一站式
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4.二代測(cè)序：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、smallRNA測(cè)序、snoRNA測(cè)序、TRF測(cè)序
5.芯片：信號(hào)通路pcr芯片蛋白芯片
6.表觀遺傳實(shí)驗(yàn)：DNA甲基化實(shí)驗(yàn)（BSP,MSP，焦磷酸測(cè)序），RNA甲基化實(shí)驗(yàn)
7.實(shí)時(shí)定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(靶基因驗(yàn)證，過(guò)表達(dá)，干擾),基因突變及SNP檢測(cè)，F(xiàn)ISH，RNA-PULLdown，rip，chip實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞增殖，凋亡，流式等細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)