為了完全理解HoxBlinc過(guò)表達(dá)調(diào)控HSPC造血轉(zhuǎn)錄程序的機(jī)制，進(jìn)行了ChIRP-seq在WT和HoxBlincTg Lin - c-Kit+細(xì)胞中繪制基因組HoxBlinc結(jié)合位點(diǎn)。HoxBlinc的過(guò)表達(dá)***增加了其與HoxB前基因啟動(dòng)子區(qū)域和其他反式靶點(diǎn)的結(jié)合，如Stat1、Cdr2、Wnt5a、Runx1和后HoxA基因（圖5d）。Lin-c-Kit+細(xì)胞基因組中HoxBlinc結(jié)合位點(diǎn)的整體分布表明，HoxBlinc主要與非編碼區(qū)相互作用，包括基因間區(qū)、內(nèi)含子和啟動(dòng)子。值得強(qiáng)調(diào)的是，HoxBlinc的過(guò)表達(dá)***增加了其與啟動(dòng)子和UTR的占用（圖5e）。整合來(lái)自WT和HoxBlincTg HSPC的ChIRP-seq、RNA-seq和ATAC-seq數(shù)據(jù)集顯示，大約74%的基因HoxBlinc結(jié)合增加表現(xiàn)在基因表達(dá)水平增加兩倍以上（圖5f），44.7%的基因表現(xiàn)出啟動(dòng)子染色質(zhì)可及性增強(qiáng)（圖5g）。這些數(shù)據(jù)表明，HoxBlinc直接結(jié)合造血特異性靶基因，主要是NPM1c+特征基因，并介導(dǎo)染色質(zhì)的長(zhǎng)程相互作用，驅(qū)動(dòng)HSPC的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。將 CTD 暴露與 CTD 解剖學(xué)相結(jié)合使環(huán)境健康科學(xué)家能夠調(diào)查暴露研究和組織和系統(tǒng)暴露化學(xué)應(yīng)激誘導(dǎo)表型的細(xì)節(jié)。焦亡活化課題分子生物學(xué)
1）SsD在AML中表現(xiàn)出抗增殖活性
為了闡明SsD在白血病中的藥理作用，我們?cè)?0個(gè)人白血病細(xì)胞系中探討了一系列SsD濃度的影響。我們發(fā)現(xiàn)SsD在大多數(shù)白血病細(xì)胞系中以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞活力(圖1A)。為了進(jìn)一步研究SsD對(duì)白血病的抑制作用，我們?cè)?種白血病細(xì)胞系NB4、kas1、MV4-11和U937(SsD敏感性排名前4位的細(xì)胞)進(jìn)行了集落實(shí)驗(yàn)。與細(xì)胞活力結(jié)果相似，SsD***抑制了所測(cè)細(xì)胞系的集落數(shù)量和大小(圖1B-E)。有趣的是，SsD對(duì)細(xì)胞增殖和活力的抑制可能是由于細(xì)胞周期阻滯在G1期和NB4細(xì)胞凋亡增加(圖1F-G)。 M6a甲基化課題代發(fā)服務(wù)有肝轉(zhuǎn)移的PDAC患者外泌體CD44v6和C1QBP的表達(dá)明顯高于無(wú)肝轉(zhuǎn)移的PDAC患者。
YTHDC2調(diào)節(jié)SLC7A11 mRNA的穩(wěn)定性(圖5A-D)，而控制RNA衰減是m6A甲基化的重要功能之一。作者先驗(yàn)證METTL3刺激m6A的能力(圖5E、F)。在H1975細(xì)胞中敲降METTL3延長(zhǎng)了SLC7A11 mRNA的半衰期，而在H1299細(xì)胞中過(guò)表達(dá)METTL3則加速了SLC7A11 mRNA的降解(圖5G)。此外，H1299細(xì)胞中降低METTL3表達(dá)阻斷了YTHDC2，從而減緩SLC7A11 mRNA的衰減，刺激胱氨酸攝取并減弱脂質(zhì)活性氧(ROS)的生成(圖5H-J)，這表明YTHDC2在LUAD細(xì)胞中的作用是依賴m6A。
6.YTHDC2傾向于相互作用并使m6A甲基化的SLC7A11mRNA不穩(wěn)定
為了揭示SLC7A11mRNA中潛在的m6A甲基化位點(diǎn)，在H1975細(xì)胞中METTL3敲除前后分別進(jìn)行了MeRIP-seq研究。在H1975細(xì)胞中，無(wú)論是否敲除METTL3,GGACmotif都高度富集于m6A位點(diǎn)(圖6A)。m6A峰在mRNA停止密碼子附近的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)尤為豐富(圖6B)。為了進(jìn)一步證實(shí)SLC7A11mRNA的m6A依賴性修飾，我們進(jìn)行MeRIP-qPCR。在H1975細(xì)胞中，敲除METTL3后，SLC7A11mRNA中的m6A修飾明顯減少，特別是在假定的m6A位點(diǎn)周圍。相反，當(dāng)METTL3在H1299細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，觀察到相反的結(jié)果(圖6C)。
四、FZD7是YTHDF1中真正的m6A修飾靶標(biāo)
對(duì)于***腹肌Hippo或Wnt通路的13個(gè)轉(zhuǎn)錄本，我們采用了多步驟篩選策略(圖4A)。使用RIP結(jié)合qPCR驗(yàn)證確定YTHDF1相互作用的轉(zhuǎn)錄本（4B）。Wnt途徑的FZD1、FZD7、CTBP2、MAPK9、MAP3K7等轉(zhuǎn)錄本，以及Hippo途徑的TP53BP1、PARD3、SMAD2、SMAD3等轉(zhuǎn)錄本均被YTHDF1抗體特異性免疫沉淀(4C)。YTHDF1基因敲除****降低了FZD7、MAPK9、SMAD2、SMAD3和PARD3的蛋白水平(圖4D)，但它們的mRNA未受影響。m6A免疫沉淀反應(yīng)(m6A-IP)和YTHDF1 eCLIP和qPCR證實(shí)YTHDF1 對(duì)FZD7, MAPK9, SMAD2 SMAD3,和PARD3 mrna進(jìn)行m6A修飾。FZD7的翻譯效率下調(diào)*****，而其他基因的翻譯效率均出現(xiàn)輕微的抑制(圖4G)。這些結(jié)果共同提示FZD7是YTHDF1在胃*中真正的直接靶點(diǎn)。 caspase-3抗體是一種***用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞的標(biāo)志物。
4、hnRNPA2B1在外泌體miR-934向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用
據(jù)報(bào)道，外泌體RNA的分泌需要一種特定的RNA結(jié)合蛋白來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)RNApull-down分析和質(zhì)譜分析，鑒定了三種可能參與miR-934轉(zhuǎn)運(yùn)的RNA結(jié)合蛋白，并發(fā)現(xiàn)敲除hnRNPA2B1可以降低外泌體miR-934的表達(dá)（Fig.4a,b）。hnRNPA2B1是一種RNA結(jié)合蛋白，通過(guò)與特定基序GGAG/CCCU結(jié)合，參與miRNAs的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。特別是，由于miR-934序列中有兩個(gè)GGAG基序，我們推測(cè)hnRNPA2B1可能通過(guò)與GGAG序列結(jié)合，介導(dǎo)miR-934包裝成外泌體的過(guò)程。此外，miRNApull-down分析顯示，在細(xì)胞質(zhì)和外泌體中，miR-934和hnRNPA2B1之間存在***的結(jié)合關(guān)系，然而，突變miR-934的結(jié)合序列(GGAG)可削弱這種結(jié)合（Fig.4c）。RNA免疫沉淀分析進(jìn)一步證明，無(wú)論是在CRC細(xì)胞及其外泌體裂解物中，miR-934在anti-hnrnpa2b1抗體組中比在anti-IgG抗體組中更***富集（Fig.4d）。此外，敲除hnRNPA2B1可以抑制外泌體miR-934從HCT8和LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞的過(guò)程（Fig.4e）。因此，這些結(jié)果證實(shí)hnRNPA2B1可以通過(guò)與miR-934的GGAG序列結(jié)合，介導(dǎo)miR-934包裝到CRC細(xì)胞外泌體中，并將外泌體miR-934轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞中。 可以上傳原始的fast文件。鐵死亡課題
使用motif和CHIP-seq預(yù)測(cè)影響基因簇表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。焦亡活化課題分子生物學(xué)
在Fth- KO小鼠中， TBI后褪黑素對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用被**取消
為了進(jìn)一步探索神經(jīng)元Fth的喪失是否影響褪黑素對(duì)TBI誘導(dǎo)的鐵死亡的影響，測(cè)量了鐵死亡的幾種假定的生物標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)***KO小鼠上皮層非血紅素鐵的水平?jīng)]有影響。令人驚訝的是，盡管褪黑素***的和未***的Fth -KO小鼠的Tfr1 mRNA和蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，但是在褪黑素***的小鼠中，觀察到Fpn mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加Fth- KO小鼠。值得注意的是，與未***的Fth- KO小鼠相比，用褪黑素***Fth- KO小鼠未能顯著改變mRNA（Slc7a11，Ptgs2）和蛋白質(zhì)（xCT，Cox2、4HNE）的表達(dá)。另外，用褪黑素***Fth- KO小鼠并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上降低GSH和MDA以及4HNE的水平，和FJB陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。這些結(jié)果表明褪黑素沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上減少TBI引起的鐵死亡和神經(jīng)元變性。 焦亡活化課題分子生物學(xué)
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7.實(shí)時(shí)定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(靶基因驗(yàn)證，過(guò)表達(dá)，干擾),基因突變及SNP檢測(cè)，F(xiàn)ISH，RNA-PULLdown，rip，chip實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞增殖，凋亡，流式等細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)