另外，相對于對照組，在生理?xiàng)l件下，單獨(dú)使用siFth不能顯著增加ROS的產(chǎn)生。對鐵死亡的抗性與抑制BODIRY-C11氧化有關(guān)。與上述ROS結(jié)果一致。測量了鐵死亡的幾種推定生物標(biāo)志物，包括xCT，Cox2和4HNE表達(dá)。如預(yù)期的那樣，與對照組+刮擦損傷組相比，在siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細(xì)胞中，刮擦損傷的xCT表達(dá)顯著下降，而Cox-2和4HNE的表達(dá)顯著增加。重要的是，與未經(jīng)***的siFth組相比，用褪黑素處理siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細(xì)胞在刮傷后未能顯著改變xCT，Cox2和4HNE的表達(dá)。另外，在生理?xiàng)l件下，單獨(dú)的siFth與對照組之間上述蛋白質(zhì)的表達(dá)沒有顯著差異。這些結(jié)果表明，用siFth轉(zhuǎn)染的HT-22細(xì)胞易受機(jī)械性刮擦損傷誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的影響，而褪黑素在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并未減輕損傷后的鐵死亡，并且siFth不會(huì)影響褪黑素受體的表達(dá)。課題外包服務(wù)找英拜放心安心。淋巴水腫鼠模型
二、改進(jìn)標(biāo)簽轉(zhuǎn)移和差異分析
研究了方法差異對下游生物學(xué)分析的影響
A.B.去除中性粒細(xì)胞**提高了在細(xì)胞核和細(xì)胞的均勻流形近似和投影(UMAP)投影中分離各種細(xì)胞類型的能力.
C使用這些工具，中性粒細(xì)胞的去除提高了標(biāo)記轉(zhuǎn)移評分，與核基方法相比，滲透性細(xì)胞產(chǎn)生了更多具有高標(biāo)記轉(zhuǎn)移評分的細(xì)胞.
D所有方法產(chǎn)生的CD16+單核細(xì)胞均少于流式細(xì)胞術(shù)觀察到的CD16+單核細(xì)胞，這表明無論是使用核或通透細(xì)胞的scATAC-seq過程中，CD16+單核細(xì)胞可能丟失，或者標(biāo)簽轉(zhuǎn)移方法不利于識(shí)別這種細(xì)胞類型. 耐藥性***ATM對PTEN的磷酸化增加了DNA損傷后AKT和p27Kip1的***。
為了驗(yàn)證tRFs&tiRNA-Seq數(shù)據(jù)，作者檢測了91對PTC組織和*旁組織中tRFs&tiRNA的表達(dá)，其中，tiRNA-Gly在人類PTC組織中的表達(dá)水平比較高，并***高于*旁組織（圖1F-G）。WB顯示，tiRNA-Gly在PTC**中蛋白表達(dá)***高于*旁，但是tRNA-Gly的表達(dá)在*和*旁中無***差異（圖1H）?？傊?，tiRNA-Gly可能在PTC的進(jìn)展中起致*作用。2、在小鼠模型中，tiRNA-Gly調(diào)節(jié)PTC細(xì)胞的增殖和遷移，并影響**生長
首先檢測了tiRNA-Gly在3株P(guān)TC細(xì)胞系中的表達(dá)，如圖2A所示，K1細(xì)胞系中tiRNA-Gly的表達(dá)***低于BCPAP和TPC-1細(xì)胞系。因此，對于功能獲得性實(shí)驗(yàn)，合成帶有5’磷酸末端的tiRNA-Gly轉(zhuǎn)染至K1細(xì)胞系（圖2B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，tiRNA-Gly***促進(jìn)K1細(xì)胞的增殖和遷移（圖2C-D）。對于功能缺失實(shí)驗(yàn)，在BCPAP和TPC-1細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染siRNA干擾tiRNA-Gly的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞的增殖和遷移都***下降（圖2E-G）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得出了類似的結(jié)果，干擾tiRNA-Gly表達(dá)導(dǎo)致**體積減小，Ki67表達(dá)下降?？傊?，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都表明tiRNA-Gly是PTC的惡性因子。
在整個(gè)細(xì)胞群中，2D-R和2W-R樣本之間沒有明顯的差異，這表明暴露在s-flow條件下2天或2周的細(xì)胞基本沒有變化。S-flow條件下(2D-R和2W-R)很少發(fā)現(xiàn)SMC，而急性d-flow條件下(2D-L)SMC數(shù)量增加至2.3%，慢性d-flow條件下(2W-L)SMC數(shù)量進(jìn)一步增加至18.2%。四種情況下都有成纖維細(xì)胞，其中在急性d-flow情況下**多(2D-L時(shí)為17%)(圖1D)對2D-R、2D-L、2W-R、2W-L4個(gè)樣本的序列reads使用R軟件包進(jìn)行分析。UMAP分析將總核群劃分為13個(gè)細(xì)胞群，它們以流量和時(shí)間依賴的方式分布(圖1E和1F)。通過Signac將scATAC-seq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為基因活性指數(shù)，并使用上述scRNA-seq研究中描述的相同標(biāo)記基因確定細(xì)胞身份。在13個(gè)簇中，8個(gè)是內(nèi)皮簇(E1E8)，其次是SMCs、Fibro、巨噬細(xì)胞、dc、T細(xì)胞和未定義(ND)(圖1G)。TIMEOR是***個(gè)基于 Web 的自適應(yīng)時(shí)間序列多組學(xué)管道方法。
4.YTHDC2抑制依賴于SLC7A11的胱氨酸攝取
Xc-系統(tǒng)是一個(gè)胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，捕獲細(xì)胞外的胱氨酸，用于谷胱甘肽的合成，以交換谷氨酸的釋放。在圖3中，被抑制的Xc-系統(tǒng)功能與YTHDC2受損的胱氨酸攝取有關(guān)，然而YTHDC2如何調(diào)節(jié)Xc-系統(tǒng)依然未知。文獻(xiàn)報(bào)道催化亞基SLC7A11在維持Xc-系統(tǒng)活性方面起著重要作用。作者通過IB和RT-qPCR發(fā)現(xiàn)，SLC7A11蛋白和mRNA水平均受YTHDC2負(fù)調(diào)控(圖4A、B)。在小鼠中，與KPE和KPYΔYTH小鼠相比，KPYWT小鼠的**中SLC7A11表達(dá)下調(diào)(圖4C、D)。這證明YTH結(jié)構(gòu)域是YTHDC2抑制SLC7A11表達(dá)的前提。 zVAD預(yù)處理也略微增加了IR后PTEN-398A細(xì)胞中未解決的DNA損傷灶的數(shù)量。蛋白組學(xué)
致力于醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)和相關(guān)生物醫(yī)學(xué)課題的研究。淋巴水腫鼠模型
表達(dá)PTENWT的細(xì)胞，在雙胸苷激酶阻斷和輻射釋放后被阻滯在S期，表現(xiàn)出低水平的CDK2磷酸化(圖5A)。相反，經(jīng)過相同處理的PTEN-398A細(xì)胞有更高水平的磷酸化CDK2(圖5A)，這與DNA損傷檢查點(diǎn)的缺陷***一致。與PTEN-WT細(xì)胞相比，PTEN-398細(xì)胞中磷酸化的AKT和磷酸化的p27Kip1水平更高(圖5B)。雖然p27Kip1與CDK2和CyclinE在照射過的PTEN-WT細(xì)胞中有效地共免疫沉淀，但在PTEN-398A細(xì)胞中這些相互作用減弱(圖5C,D)。與我們在MCF10A細(xì)胞中觀察到的結(jié)果一致，免疫印跡分析顯示PTEN398A/398A裂解物中磷酸化的AKT和磷酸化的p27Kip1水平更高;MMTVNeu**與Pten+/+;MMTVNeu對應(yīng)**進(jìn)行比較(圖5E-H)?？傊?，***ATM對PTEN的磷酸化增加了DNA損傷后AKT和p27Kip1的***，反過來有利于CDK2/CyclinE復(fù)合物的活性，并驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程。五、阻斷atm依賴的磷酸化會(huì)損害DNA損傷后PTEN的亞細(xì)胞再分配研究了磷脂酰肌醇3,4,5磷酸(PIP3)在DNA損傷后的細(xì)胞定位。將MCF10A細(xì)胞按上述方法同步輻照，免疫熒光法分析PTEN的亞細(xì)胞分布。PTEN-WT和PTEN-398A蛋白在細(xì)胞核和質(zhì)膜穩(wěn)定定位(圖6A,B)。經(jīng)過IR處理后，PTEN-WT在質(zhì)膜上積累(圖6A,B)。相比之下，在這些條件下，沒有檢測到PTEN-398A蛋白的重新定位(圖6A,B)。淋巴水腫鼠模型
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7.實(shí)時(shí)定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(靶基因驗(yàn)證，過表達(dá)，干擾),基因突變及SNP檢測，F(xiàn)ISH，RNA-PULLdown，rip，chip實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞增殖，凋亡，流式等細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)