操作流程:.待測(cè)基因序列片段或位點(diǎn)甲基化引物設(shè)計(jì)(300p以內(nèi))。"利用甲基化轉(zhuǎn)移酶修飾的DNA和非甲基化修飾的DNA制備標(biāo)準(zhǔn)品(0%，1%,59%，109%,20%,50%。100%梯度HRM標(biāo)準(zhǔn)曲線)●亞硫酸氫鹽處理樣品DNA.上機(jī)檢測(cè)●數(shù)據(jù)處理,形成報(bào)告(包括實(shí)驗(yàn)過程、試劑耗材、熒光PCR儀原始文件、測(cè)序文件等)。實(shí)驗(yàn)實(shí)例:對(duì)2個(gè)病例的某基因20個(gè)CG位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。分析出不同的甲基化程度。操作流程:●DNA亞硫酸鹽處理用焦磷酸測(cè)序?qū)ｉT弓|物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增預(yù)實(shí)驗(yàn)及正式實(shí)驗(yàn)●PCR產(chǎn)物.上焦磷酸測(cè)序儀檢測(cè)深度測(cè)序保證了抽樣隨機(jī)性,可靠性和重復(fù)性高,與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果具有較高的一致性。內(nèi)分泌測(cè)序動(dòng)物模型構(gòu)建
piRNA是一類長(zhǎng)度為26~31nt單鏈的小RNA,大部分集中在29~30nt。piRNA的表達(dá)具有組織特異性,只存在于具有全能性的動(dòng)物細(xì)胞,如生殖細(xì)胞、**細(xì)胞和干細(xì)胞等。piRNA通過與Piwi亞家族蛋白結(jié)合形成piRNA復(fù)合物(piRC)來發(fā)揮生物學(xué)功能(沉默轉(zhuǎn)錄基因過程,維持生殖系和干細(xì)胞功能,調(diào)節(jié)翻譯和mRNA的穩(wěn)定性)。此外，piRNA在一些痘癥細(xì)胞中存在異常表達(dá)的現(xiàn)象,提示piRNA可能參與**的發(fā)生,并可作為**診斷和***中的潛在生物標(biāo)記物。PiRNA的沉默機(jī)制主要利用(1)通過轉(zhuǎn)錄自與轉(zhuǎn)座元件(TE)加工而成piRNA,并結(jié)合互補(bǔ)結(jié)合TE抑制其轉(zhuǎn)錄;(2)通過編碼蛋白基因區(qū)轉(zhuǎn)錄加工成piRNA,與AGO3,AUB蛋白形成復(fù)合體抑制靶基因:(3)由基因3'UTR轉(zhuǎn)錄生成piRNA，并結(jié)合與PIW1,抑制靶基因:(4)從piRNA簇生成piRNA,并與AUB等蛋白相互作用起到抑制靶基因的目的。(5)另外,piRNA也被報(bào)道有起到高甲基化調(diào)控的協(xié)同調(diào)控行為。piRNA的生成加工過程途徑(BiogenesisPathway)主要分為二大類:(a)轉(zhuǎn)錄自TE轉(zhuǎn)錄元件或piRNA簇的反義鏈經(jīng)過加工,加載到蛋白AUB或PIWI上形成功能piRNA。通常piRNA介導(dǎo)的piRISC復(fù)合體起到引發(fā)第二種生成加工途徑的激發(fā)作用。(b)通過AUB和AGO3蛋白的剪接體翠功能發(fā)生piRNA擴(kuò)增效應(yīng)。寧夏測(cè)序細(xì)胞實(shí)驗(yàn)依托強(qiáng)大的生物信息分析平臺(tái)，鑒定已知小RNA,并預(yù)測(cè)新的小RNA及其靶標(biāo)基因。
二、甲基化特異性的PCR實(shí)驗(yàn)流程(methylation-specificPCR,MSP)原理:甲基化特異性的PCR是-種靈敏度高且操作相對(duì)簡(jiǎn)單的甲基化研究方法。重亞硫酸鹽處理DNA后,基因組DNA發(fā)生的由甲基化狀態(tài)決定的序列改變。隨后進(jìn)行引物特異性的PCR。該方法弓|物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。MSP中設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，即一對(duì)結(jié)合處理后的甲基化DNA鏈(引物對(duì)M),另一對(duì)結(jié)合處理后的非甲基化DNA鏈(引物對(duì)U)。檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用引物M能擴(kuò)增出片段,則說明檢測(cè)位點(diǎn)存在甲基化;若用弓|物U擴(kuò)增出片段,則說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化(圖3)。該方法優(yōu)點(diǎn)是:1.檢測(cè)靈敏度高,樣品消耗少，*需1μg的基因組DNA,可用于石蠟包埋樣本;2.快速、簡(jiǎn)單，省時(shí):3.如果結(jié)合Real-time定量PCR技術(shù)(Taqman探針)則能對(duì)樣品中檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行定量檢測(cè)(Metylight)。
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究對(duì)象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和,主要包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn),通過新一代高通量測(cè)序,能夠***快速地獲得某一物種特定組織或***在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息,已曠泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。技術(shù)優(yōu)勢(shì)。任意物種的全轉(zhuǎn)錄組分析:無需預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針,因此無需了解物種基因或基因組信息,能夠直接對(duì)任何物種進(jìn)行*****的轉(zhuǎn)錄組分析。全基因組重測(cè)序已經(jīng)成為動(dòng)植物育種、群體進(jìn)化、藥物研發(fā)、疾病研究和臨床診斷中迅速而有效的方法之一。
三案例分析1.通過RNA測(cè)序分析帕金森病中白血球的長(zhǎng)鏈非編碼RNA及選擇性剪接的調(diào)控背景:人類壽命的延長(zhǎng)伴隨著神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病幾率的增加,因而價(jià)格不貴的血液診斷的發(fā)展迫在眉睫。通過RNA-seq分析血液細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本是發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物的非常高效的途徑。目的:利Ilumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)帕金森病人白血球中IncRNAs進(jìn)行分析,探討其對(duì)mRNA選擇性剪接的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果:通過對(duì)帕金森病人的RNA-seq結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),在白血球中有6000個(gè)以上IncRNAS,其中13個(gè)IncRNAS較對(duì)照組表達(dá)變化***,例如U1剪接體IncRNA,RP11-462G22.1等。同時(shí),在帕金森病人的大腦中表達(dá)7000多種IncRNAS,其中有3495種與白血球是共表達(dá)的。該研究為帕金森及其他神經(jīng)退行性疾病的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究提供了新的思路。利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。河南測(cè)序中標(biāo)率高
人全外顯子組測(cè)序技術(shù)已逐步應(yīng)用到單基因致病基因和復(fù)雜疾病易感基因研究中。內(nèi)分泌測(cè)序動(dòng)物模型構(gòu)建
三、SNP檢測(cè)及在基因組的分布在全基因組一致性序列的基礎(chǔ)上,從中提取全基因組中所有的潛在多態(tài)性位點(diǎn),再根據(jù)質(zhì)量值、深度、重復(fù)性等因素做進(jìn)一步的過濾篩選,**終得到高可信度的SNP數(shù)據(jù)集。根據(jù)已有的基因集對(duì)檢測(cè)到得變異進(jìn)行注釋。四、InDel檢測(cè)及在基因組的分布使用測(cè)序個(gè)體的短序列與參考基因組進(jìn)行Paired-End比對(duì),將比對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析,并結(jié)合Paired-End關(guān)系檢測(cè)可信的shortInDel.在檢測(cè)過程中,gap的長(zhǎng)度為1~3個(gè)堿基。對(duì)于每個(gè)InDel的檢測(cè)，至少需要3個(gè)雙末端序列的支持。五、結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)及在基因組中的分布利用測(cè)序個(gè)體序列與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì),檢測(cè)全基因組水平的結(jié)構(gòu)變異,目前能夠檢測(cè)到得結(jié)構(gòu)變異類型主要有缺失插入、復(fù)制、倒位、易位等,并根據(jù)已有的基因集對(duì)檢測(cè)到得變異進(jìn)行注釋。內(nèi)分泌測(cè)序動(dòng)物模型構(gòu)建
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4.二代測(cè)序：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、smallRNA測(cè)序、snoRNA測(cè)序、TRF測(cè)序
5.芯片：信號(hào)通路pcr芯片蛋白芯片
6.表觀遺傳實(shí)驗(yàn)：DNA甲基化實(shí)驗(yàn)（BSP,MSP，焦磷酸測(cè)序），RNA甲基化實(shí)驗(yàn)
7.實(shí)時(shí)定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(靶基因驗(yàn)證，過表達(dá)，干擾),基因突變及SNP檢測(cè)，F(xiàn)ISH，RNA-PULLdown，rip，chip實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞增殖，凋亡，流式等細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)