3、MAO-A促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化
為了研究MAO-A對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控，體外培養(yǎng)MaoaWT和KOBMDMs，并通過添加***刺激（IL4和IL-13）使這些巨噬細(xì)胞向免疫抑制表型極化（圖3a）。觀察到，在M-CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分化過程中，MaoamRNA的表達(dá)在Maoa野生型BMDMs中有明顯的誘導(dǎo)作用，Maoa在成熟的BMDMs中表達(dá)趨于穩(wěn)定，并維持IL-4/IL-13誘導(dǎo)的免疫抑制極化（圖3b-c）。MaoaKOBMDMs中MAO-A表達(dá)未檢測到，證實(shí)了其MAO-A缺失基因型（圖3b,d）。與野生型巨噬細(xì)胞相比，在IL-4/IL-13刺激下，MaoaKO巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更低的免疫抑制表型，這在其免疫抑制標(biāo)記物的表達(dá)減少中得到了證明（圖3e-g）。在巨噬細(xì)胞/T細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)中（圖3h），IL-4/IL-13極化的MaoaKO巨噬細(xì)胞在抗CD3/CD28刺激下，與免疫抑制表型的減弱一致，其對(duì)野生型CD8+T細(xì)胞的抑制作用減弱（圖3i-k）。 高通量分子實(shí)驗(yàn)的后續(xù)標(biāo)書申請(qǐng)指導(dǎo)服務(wù)。生物相關(guān)課題創(chuàng)新服務(wù)
2）circPDE4B調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞活力和ECM代謝
為了評(píng)估circPDE4B在ECM代謝中的作用，我們分別用三種circPDE4BsiRNA轉(zhuǎn)染HCs(圖2A)。我們使用CCK-8方法評(píng)估了circPDE4B對(duì)軟骨細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，敲低circPDE4B的表達(dá)降低了軟骨細(xì)胞的活力(圖2B)。此外，shRNA腺病毒抑制circPDE4B***提高了MMP3、MMP13和ADAMTS4的表達(dá)，而SOX9、COL2A1(或COL2蛋白)和aggrecan在HCs/MCs中的表達(dá)下調(diào)(圖2C和圖2D)。免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)，circPDE4B敲除影響了HCs/MCs的MMP3、MMP13、COL2和aggrecan水平(圖2E、F)。同時(shí)，HCs的阿爾新藍(lán)染色顯示，circPDE4B抑制導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能障礙，蛋白多糖藍(lán)染較少(圖2G)。然后通過CCK-8實(shí)驗(yàn)(圖2H)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circPDE4B增加了軟骨細(xì)胞的活力。在過表達(dá)circPDE4B-HCs中，MMP3、MMP13和ADAMTS4的mRNA和蛋白水平下調(diào)，SOX9、COL2A1(或COL2蛋白)和aggrecan的mRNA和蛋白水平上調(diào)(圖2I-L)。此外，HCs的阿爾新藍(lán)染色表明，與單獨(dú)IL-1β***相比，circPDE4B過表達(dá)和IL-1β共處理減少了軟骨破壞(圖2M)。這些數(shù)據(jù)表明，circPDE4B/circPde4b在HCs中可以促進(jìn)細(xì)胞活力，抑制分解代謝作用。 生物相關(guān)課題創(chuàng)新服務(wù)進(jìn)一步了解阻斷atm依賴的PTEN磷酸化如何影響細(xì)胞對(duì)基因毒性損傷的反應(yīng)。
1）NOX4水平在阿爾茨海默病患者皮質(zhì)區(qū)受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中升高
為了探討NOX4在AD患者星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用，我們分析了AD患者大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOX4蛋白水平是否升高。我們采用免疫熒光染色法檢測AD患者或非AD供者(正常)顳葉皮質(zhì)組織GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的NOX4蛋白水平(圖1A和B)。免疫熒光染色顯示AD患者皮質(zhì)區(qū)分子層GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOX4陽性染色強(qiáng)度相對(duì)于非AD供者增加(圖1A)。此外，AD患者皮質(zhì)區(qū)ML中受損的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的NOX4陽性染色強(qiáng)度高于非AD供者(圖1A和B)。值得注意的是，AD患者中NOX4與GFAP亞細(xì)胞共定位陽性的受損星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量***增加(圖1C)。與非AD供者相比，每一位AD患者的NOX4水平普遍較高。這些結(jié)果提示，AD患者星形膠質(zhì)細(xì)胞受損時(shí)NOX4蛋白水平升高。
2、CFL1的高表達(dá)與HCC的不良預(yù)后相關(guān)單變量分析顯示，**大小、**數(shù)量、TNM分期、靜脈浸潤、HBV***和CFL1水平與HCC患者的總體生存率***相關(guān)（表2）。多變量分析顯示，***大小、**數(shù)量、靜脈浸潤和CFL1水平是HCC總體生存率的**預(yù)后指標(biāo)（表2）。并且，可以看出CFL1的高表達(dá)與HCC的不良預(yù)后相關(guān)。
3、CFL1促進(jìn)HCC的增殖，遷移和侵襲如圖2所示，在高表達(dá)CFL1的HCCLM3和MHCC97h細(xì)胞中，敲除CFL1(圖2A)。隨后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除CFL1后HCCLM3和MHCC97h細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力被抑制，表明CFL1促進(jìn)HCC的增殖，遷移和侵襲。 高通量測序后續(xù)的機(jī)制實(shí)驗(yàn)。
9）M1-Exos通過miR-155/SOCS6/p65軸加重了bEnd.3細(xì)胞的EndoMT
為了探討外泌體miR-155/SOCS6/p65軸在M1-Exos誘導(dǎo)的EndoMT中的作用，我們在體外進(jìn)行了一系列功能喪失和功能獲得實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，SOCS6過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了miR-NCOE-Exos或miR-155OE-Exos誘導(dǎo)的TEER值降低和通透性增加(圖9A和B)。ZO-1和Occludin的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步顯示SOCS6過表達(dá)***逆轉(zhuǎn)了miR-NCOE-Exos或miR-155OE-Exos在bEnd.3細(xì)胞中引起的TJs破壞(圖9C)。此外，EndoMT標(biāo)記物的蛋白水平與這些結(jié)果一致，SOCS6上調(diào)可消除miR-NCOE-Exos或miR-155OE-Exos介導(dǎo)的p65上調(diào)(圖9D)。值得注意的是，當(dāng)miR-NCKD-Exos或miR-155KD-Exos下調(diào)SOCS6時(shí)，則出現(xiàn)相反的結(jié)果(圖9E-H)。 有肝轉(zhuǎn)移的PDAC患者外泌體CD44v6和C1QBP的表達(dá)明顯高于無肝轉(zhuǎn)移的PDAC患者。cancer課題技術(shù)指導(dǎo)
生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的精細(xì)研究。生物相關(guān)課題創(chuàng)新服務(wù)
6）NOX4誘導(dǎo)的線粒體代謝損傷通過抑制人類星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞抗氧化過程而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激
我們研究了NOX4誘導(dǎo)的線粒體代謝損傷是否可以通過抑制人體星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞抗氧化過程來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。與對(duì)照組相比，NOX4的升高***降低了谷胱甘肽(GSH)水平和谷胱甘肽/氧化谷胱甘肽(GSSG)的比值(圖6A和B)。NOX4的升高也增加了GSSG的水平(圖6C)。由于NOX4導(dǎo)致GSH減少以及GSH/GSSG比值降低，我們接下來研究NOX4是否可以影響人類星形膠質(zhì)細(xì)胞中NRF2信號(hào)通路，這是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子。與對(duì)照組相比，NOX4的升高抑制了NRF2在細(xì)胞質(zhì)中的核易位(圖6D)。此外，NRF2靶基因HO-1和GCL的水平和活性在人星形膠質(zhì)細(xì)胞中被NOX4過表達(dá)***抑制(圖6E和F)。這些結(jié)果表明，NOX4誘導(dǎo)的線粒體代謝損傷通過抑制人星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞抗氧化過程而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。 生物相關(guān)課題創(chuàng)新服務(wù)
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4.二代測序：轉(zhuǎn)錄組測序、smallRNA測序、snoRNA測序、TRF測序
5.芯片：信號(hào)通路pcr芯片蛋白芯片
6.表觀遺傳實(shí)驗(yàn)：DNA甲基化實(shí)驗(yàn)（BSP,MSP，焦磷酸測序），RNA甲基化實(shí)驗(yàn)
7.實(shí)時(shí)定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(靶基因驗(yàn)證，過表達(dá)，干擾),基因突變及SNP檢測，F(xiàn)ISH，RNA-PULLdown，rip，chip實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞增殖，凋亡，流式等細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)