對離體培養(yǎng)的Maoa野生型和KOBMMDs中ROS水平的測定也顯示，在IL-4/IL-13刺激或不刺激下，MaoaKOBMMDs中ROS水平降低，與體內(nèi)TAM結(jié)果一致（圖4d）。向IL-4/IL-13刺激的MaoaWT和KOBMDMs補充H2O2可將其細(xì)胞內(nèi)ROS水平提高到相似水平，并消除它們在免疫抑制標(biāo)記物和特征基因表達(dá)的差異（圖4e-g）。另一方面，補充酪氨酸(MAO-A的底物)可增加ROS水平，并上調(diào)免疫抑制基因在MaoaWTBMDMs中的表達(dá)，但在MaoaKOBMDMs中不上調(diào)（圖4h-j）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明MAO-A通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫抑制極化。將 CTD 暴露與 CTD 解剖學(xué)相結(jié)合使環(huán)境健康科學(xué)家能夠調(diào)查暴露研究和組織和系統(tǒng)暴露化學(xué)應(yīng)激誘導(dǎo)表型的細(xì)節(jié)。廣東課題歡迎咨詢
作者進(jìn)行了PAR-CLIP實驗，以評估SLC7A11 mRNA-YTHDC2相互作用是否依賴于m6A甲基化。結(jié)果表明，在H1299細(xì)胞中，通過過表達(dá)METTL3來提高m6A的甲基化水平，促進(jìn)YTHDC2與SLC7A11 mRNA的結(jié)合(圖6D)。無論METTL3是否過表達(dá)，YTH結(jié)構(gòu)域的缺失都阻斷了SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用(圖6D)。作者通過SLC7A11 3’-UTR探針進(jìn)行RNA-pull down實驗，發(fā)現(xiàn)YTHDC2WT，優(yōu)先結(jié)合于含有m6A的SLC7A11 mRNA的3'UTR，而不是含有未甲基化腺苷的mRNA(圖6E)。此外，YTHDC2傾向于結(jié)合m6A共識基元GGAC (圖6E)。通過在H1299和H1975細(xì)胞中進(jìn)行METTL3的功能增加和丟失實驗，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用是由m6A水平?jīng)Q定的(圖6F和G)。這些數(shù)據(jù)表明YTHDC2優(yōu)先與m6A甲基化的SLC7A11 mRNA結(jié)合。天津課題動物模型構(gòu)建高通量測序后續(xù)的機制實驗。
3）FTO是SsD的直接靶點
基于基因芯片數(shù)據(jù)，SsD介導(dǎo)的白血病發(fā)生抑制主要是由于m6A通路，我們假設(shè)SsD可能調(diào)節(jié)白血病m6ARNA甲基化。我們確定了FTO在白血病發(fā)生中起作用。為了驗證SsD與FTO的直接結(jié)合，我們首先基于已發(fā)表的FTO晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對接分析。SsD的比較好結(jié)合位點表現(xiàn)出與底物結(jié)合位點互補的特殊形狀，占據(jù)了整個結(jié)合口袋(圖3A-B)。4個氨基酸殘基(R96,K216,E234,R332)參與了與SsD的相互作用(圖3C)，在抑制FTO活性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在NB4和Kas-1AML細(xì)胞中，SsD與FTO蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了明顯的熱轉(zhuǎn)移，表明對熱降解有保護作用(圖3D)。接著，我們利用NMR進(jìn)一步研究了FTO和SsD之間的相互作用，在滴定過程中觀察到信號的劑量依賴性衰減(圖3E)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)TO干擾了SsD的狀態(tài)。接下來，我們使用LC-MS/MS定量分析了細(xì)胞對SsD的攝取(圖3F)。在NB4和Kas-1細(xì)胞中，SsD在0.05-0.14nmol/百萬細(xì)胞中檢測到。HPLC顯示SsD對體外FTO去甲基化的抑制活性(圖3G)。此外，在無細(xì)胞系統(tǒng)中，斑點印跡試驗證實了SsD介導(dǎo)的FTO活性競爭性抑制(圖3H)。綜上所述，F(xiàn)TO是SsD的直接靶點，可能是SsD誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞生長抑制作用的主要介質(zhì)。
6）circPde4b和RIC8A影響小鼠OA發(fā)病機制
為了證實上述發(fā)現(xiàn)，我們進(jìn)一步評估了circPde4b對小鼠OA的影響。圖6A為四組不同AAV***后circPde4b和RIC8A的RNA表達(dá)情況。從軟骨中提取的ECM相關(guān)蛋白的RT-qPCR和westernblot分析也提示在內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)(DMM)+vector組和DMM+circPde4b+RIC8A組中OA更嚴(yán)重(圖6B，C)。SafraninOfastgreen染色(圖6D)發(fā)現(xiàn)，與SHAM+載體組和DMM+circPde4b+RIC8A組相比，DMM+載體組和DMM+circPde4b+RIC8A組的蛋白多糖明顯丟失，表明circPde4bAAV可以挽救由DMM引起的OA進(jìn)展，而RIC8AAAV可以逆轉(zhuǎn)這種挽救。 英拜生物對實驗可行性分析。
2）阿爾茨海默病患者皮質(zhì)區(qū)受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化水平升高
由于NOX4蛋白水平在AD患者受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中升高，我們研究NOX4在AD患者受損星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。我們用免疫熒光染色法檢測了AD患者或非AD供者大腦顳葉皮質(zhì)組織中GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中4-HNE的蛋白水平(圖2A)。免疫熒光染色顯示，AD患者(AD)皮質(zhì)區(qū)分子層GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞中4-HNE陽性染色強度相對于非AD供者增加(圖2A、B)。此外，AD患者皮質(zhì)區(qū)ML中受損的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞4-HNE陽性染色強度高于非AD供者(圖2A和B)。AD患者中4-HNE與GFAP亞細(xì)胞共定位陽性的受損星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量***增加(圖2C)。此外，相對于非AD供體，4-HNE在AD患者的NOX4陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞***定位(圖2D)。AD患者的NOX4和4-HNE陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量相對于非AD供者***增加(圖2E)。這些結(jié)果提示AD患者受損星形膠質(zhì)細(xì)胞中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化水平升高。 Pex調(diào)節(jié)HSC的ECM分泌。新疆課題省自然科學(xué)基金
高通量測序的后續(xù)成文服務(wù)。廣東課題歡迎咨詢
五、gata1調(diào)控靶基因的染色質(zhì)可及性及表達(dá)動態(tài)
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