五、YTHDF1以m6a依賴的方式調(diào)控FZD7的表達(dá)
在GC-803和胃*細(xì)胞株基礎(chǔ)上，進(jìn)行m6A-qPCR和YTHDF1 RIP qPCR的基因特異性分析。確實(shí)，在FZD7 mRNA中觀察到兩個(gè)m6A峰，并且在MGC-803和HGC-27細(xì)胞中證實(shí)了與YTHDF1的關(guān)聯(lián)(圖5A和B)。標(biāo)記YTHDF1突變體(YTHDF1- mut)具有兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸突變(K395A, Y397A)以消除其m6binding口袋(44)，將其轉(zhuǎn)染到MGC-803和HGC- 27細(xì)胞中(圖5C)。在YTHDF1野生型(YTHDF1- wt)轉(zhuǎn)染的胃*細(xì)胞中觀察到的FZD7表達(dá)上調(diào)在YTHDF1- mut中被消除，但在YTHDF1-WT和YTHDF1-MUT兩種細(xì)胞系中，F(xiàn)ZD7的mRNA水平相當(dāng)(圖5E)。RIP-qPCR分析顯示，F(xiàn)ZD7 mRNA與突變體YTHDF1的相互作用明顯受損(圖5F)。 提供生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的課題思路設(shè)計(jì)。課題省自然科學(xué)基金
在野生型小鼠和Caspase-11缺陷小鼠中，MCD處理***降低了pro-caspase1的蛋白水平(圖5A和F)，而增加了活性Caspase-1的蛋白水平(圖5A和G)。此外，Caspase-11缺陷小鼠的活性caspase-1水平明顯低于野生型小鼠，說明MCD處理Caspase-11缺陷小鼠肝臟中Caspase-1的***較少。同樣，我們在MCD處理的Caspase-11缺陷小鼠的肝細(xì)胞中檢測到較少的Gsdmd-N表達(dá)(圖5H和I)。這些結(jié)果表明，Caspase-11缺失減弱了MCD誘導(dǎo)的Gsdmd和IL-1β的***。
6.Caspase-11缺乏抑制脂多糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡和體外損傷
我們在體外評價(jià)Caspase-11缺乏對肝細(xì)胞焦亡的影響。我們用脂多糖(LPS)處理野生型小鼠原代肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)了pro-caspase-11和caspase-11的表達(dá)(圖6A和B)，表明LPS誘導(dǎo)了原代肝細(xì)胞中caspase-11的***。我們進(jìn)一步處理來自野生型和Caspase-11缺陷小鼠的原代肝細(xì)胞，并監(jiān)測Gsdmd的表達(dá)和***。如圖6C和D所示，LPS處理未在野生型和Caspase-11缺陷的原代肝細(xì)胞中誘導(dǎo)pro-Gsdmd的表達(dá)。 常規(guī)課題創(chuàng)新服務(wù)表達(dá)PTEN- 398A的細(xì)胞中上調(diào)的基因與G1/S檢查點(diǎn)的***有關(guān)。
揭示轉(zhuǎn)錄因子如何隨著時(shí)間的推移在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平上調(diào)節(jié)其靶標(biāo)，對于定義基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRN)和分配正常和疾病狀態(tài)的機(jī)制至關(guān)重要。RNA-seq是一種使用已建立的分析階段測量基因調(diào)控的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，目前可用的用于解釋有序基因組數(shù)據(jù)（在時(shí)間或空間上）的管道方法都沒有使用時(shí)間序列模型來分配GRN內(nèi)的因果關(guān)系。此外，也需要將有序的RNA-seq數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合數(shù)據(jù)相結(jié)合以區(qū)分直接與間接相互作用的方法。TIMEOR是***個(gè)基于Web的自適應(yīng)時(shí)間序列多組學(xué)管道方法，它可以推斷基因調(diào)控事件之間的關(guān)系。TIMEOR通過利用時(shí)間序列RNA-seq、基序分析、蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，解決了對確定因果調(diào)節(jié)機(jī)制網(wǎng)絡(luò)的方法的關(guān)鍵需求。
***，分析了MAOA基因表達(dá)水平與幾種**病人臨床預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示瘤內(nèi)MAOA基因與卵巢*，淋巴*和乳腺*患者的臨床總生存率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖6o-q）。此外，黑色素瘤患者**內(nèi)高水平的MAOA表達(dá)很大程度上抵消了PD-1***提供的生存好處，提示MAO-A阻斷***與PD-1/PD-L1阻斷***聯(lián)合可能通過調(diào)節(jié)TAM極化，從而改變免疫抑制TME，提高抗**免疫能力，提供協(xié)同***好處（圖6r）。綜上所述，人類TAM和臨床相關(guān)性研究證實(shí)了MAO-A作為人類TAM中一個(gè)有前途的藥物靶點(diǎn)，并支持了MAO-A通過靶向TAM重編程阻斷**免疫***的翻譯潛力?？梢酝茢嗷蛘{(diào)控事件之間的關(guān)系。
circRNA是一種新型的非編碼RNA，已被報(bào)道通過多種機(jī)制參與疾病的發(fā)生和發(fā)展。MAPK通路是一種常見的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞增殖、炎癥和凋亡，在**中起著特別重要的作用。然而，與MAPK通路相關(guān)的circRNA在胃*中的作用尚未被探索。因此，小編為大家?guī)硪黄?021年4月發(fā)表于影響因子為15.302的雜志Molecular Cancer上的文章“A novel protein encoded by circMAPK1 inhibits progression of gastric cancer by suppressing activation of MAPK signaling”。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)circMAPK1在胃*組織中較鄰近正常組織表達(dá)下調(diào)。重要的是，較低的circMAPK1表達(dá)預(yù)示著GC患者較差的生存。CircMAPK1在體內(nèi)外均能抑制胃*細(xì)胞的增殖和侵襲。接下來，我們發(fā)現(xiàn)circMAPK1編碼了一個(gè)長度為109個(gè)氨基酸的新蛋白。通過一系列功能實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了circMAPK1通過編碼的蛋白MAPK1-109aa發(fā)揮了抑制**的作用。在機(jī)制上，**抑制因子MAPK1-109aa通過競爭性結(jié)合MEK1來抑制MAPK1的磷酸化，從而抑制MAPK1及其下游因子在MAPK通路中的***。ATM對PTEN的磷酸化驅(qū)動細(xì)胞周期進(jìn)程。炎癥課題詢問報(bào)價(jià)
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4、CLF1敲除抑制小鼠HCC的生長和肺部轉(zhuǎn)移隨后，作者在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證CLF1的功能。結(jié)果如圖3所以，敲除CFL1后***降低了HCC細(xì)胞的**體積和**，并減少了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量。IHC表明CLF1的敲除也導(dǎo)致EMT相關(guān)蛋白的抑制?？傊?，CLF1敲除抑制小鼠HCC的生長和肺部轉(zhuǎn)移。
5、CFL1是HIF-1α在HCC細(xì)胞中的下游靶基因?yàn)榱岁U明低氧對HCC中CFL1表達(dá)的影響，將HCCLM3和Hep3B細(xì)胞在低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)導(dǎo)致CFL1的表達(dá)升高，但是當(dāng)HIF-1α敲除后，低氧誘導(dǎo)并不能提高CFL1的表達(dá)，并且使用HIF-1α的抑制劑處理HCCLM3和Hep3B細(xì)胞，也能降低因低氧誘導(dǎo)導(dǎo)致CFL1表達(dá)升高（圖4A-F）。ChIP-PCR檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和HIF-1β與HCC細(xì)胞CFL1啟動子中的HRE直接結(jié)合（圖4G）。在低氧條件下，轉(zhuǎn)染HRE熒光素酶質(zhì)粒或CFL1啟動子-熒光素酶質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中熒光素酶報(bào)告基因活性升高（圖4H）。 課題省自然科學(xué)基金
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4.二代測序：轉(zhuǎn)錄組測序、smallRNA測序、snoRNA測序、TRF測序
5.芯片：信號通路pcr芯片蛋白芯片
6.表觀遺傳實(shí)驗(yàn)：DNA甲基化實(shí)驗(yàn)（BSP,MSP，焦磷酸測序），RNA甲基化實(shí)驗(yàn)
7.實(shí)時(shí)定量PCR（mRNA,LncRNA,microRNA,circRNA）,WB，RNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(靶基因驗(yàn)證，過表達(dá)，干擾),基因突變及SNP檢測，F(xiàn)ISH，RNA-PULLdown，rip，chip實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞增殖，凋亡，流式等細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)