免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所...

免疫熒光的制作：樣品準(zhǔn)備（貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞以及組織等）：對于貼壁細(xì)胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中，用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，操作小心，防止細(xì)胞脫片。對于懸浮細(xì)胞：有2種方法，①先在懸浮液中進(jìn)行固定步驟，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上，干燥后細(xì)胞會緊貼在載玻片上。②先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色步驟，離心洗脫，然后用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)染色步驟。對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作。對于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少，要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)處理。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)...

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻。抗體稀釋度1：60，較常用！8. PBS沖洗4次，各5分鐘；9加入熒光二抗，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400，較常用...

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。免疫熒光測定：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法。免疫熒光實驗步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答。P21免疫熒光分析免疫熒光的原理：免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其...

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測定相反）；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。...

熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。免疫熒光技術(shù)通過熒光信號的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位。ucp2免疫熒光細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 ...

免疫熒光技術(shù)的主要特點是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應(yīng)用。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合，從而實現(xiàn)可視化檢測。CD16...

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易...