從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長時(shí)間的研究；☆穿透能力強(qiáng)：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提...

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國家重大科研儀器研制專項(xiàng)的一個(gè)碩果。它彰顯了北京大學(xué)在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域先期布局的前瞻性，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學(xué)科交叉背景和重要技術(shù)創(chuàng)新能力的“中國智造”隊(duì)伍。目前，該研發(fā)團(tuán)隊(duì)正在領(lǐng)銜建設(shè)“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學(xué)成像”十三五國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施，積極參與即將啟動(dòng)的中國腦科學(xué)計(jì)劃?？梢云诖⑿突p光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實(shí)現(xiàn)“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰(zhàn)略目標(biāo)發(fā)揮不可或缺的重要作用雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔，提高了熒光檢測效率。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡分辨率2020年，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目...

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動(dòng)物頭部顱窗上，實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號。在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時(shí)程觀測。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢，其橫向分辨率達(dá)到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠(yuǎn)優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的、美國腦科學(xué)計(jì)劃重要團(tuán)隊(duì)所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機(jī)電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達(dá)40Hz（256*256像素），同時(shí)具備多區(qū)域隨機(jī)掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外，采用自主設(shè)計(jì)可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光...

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強(qiáng)度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)...

從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、進(jìn)...

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點(diǎn)，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點(diǎn)進(jìn)行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時(shí)就更容易對樣品進(jìn)行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個(gè)Z軸的層面，所以對于空間定點(diǎn)光刺激的實(shí)驗(yàn)定點(diǎn)位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進(jìn)行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實(shí)驗(yàn)，效率非常低。雙光子顯微鏡的基...

和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點(diǎn)偶然，但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來了一種**性的成像技術(shù)：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí)，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時(shí)，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個(gè)紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過兩個(gè)雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn)。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)...

對生物樣品的三維觀測是了解細(xì)胞功能的重要方法之一。目前已有的三維熒光成像技術(shù)包括光片顯微成像技術(shù)、晶格光照明技術(shù)以及激光掃描顯微成像技術(shù)（如共聚焦顯微鏡及雙光子顯微鏡）等。其中激光掃描顯微鏡利用旋轉(zhuǎn)盤可以進(jìn)行多焦點(diǎn)的激光掃描，提高時(shí)間分辨率，而且有利于減少活細(xì)胞成像中的光損傷。本篇文獻(xiàn)主要實(shí)現(xiàn)了可見光雙光子激發(fā)及多焦點(diǎn)激光掃描的結(jié)合，終提高了3D延時(shí)掃描中的空間分辨率及成像對比度，同時(shí)這也是可見光雙光子激發(fā)（v2PE）在超高分辨率顯微鏡中的應(yīng)用。雙光子顯微鏡已延伸到各個(gè)領(lǐng)域研究中，它能對樣品進(jìn)行三維觀察。國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡多少錢實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡...

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強(qiáng)，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對細(xì)胞的毒性。除此之外，因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗。雙光子顯微鏡非常適合對細(xì)胞組織進(jìn)行長時(shí)間在體成像。國外investigator雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)對...

配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級同時(shí)放出一個(gè)波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。國內(nèi)熒光雙光...

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動(dòng)物頭部顱窗上，實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號。在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時(shí)程觀測。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢，其橫向分辨率達(dá)到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠(yuǎn)優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的、美國腦科學(xué)計(jì)劃重要團(tuán)隊(duì)所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機(jī)電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達(dá)40Hz（256*256像素），同時(shí)具備多區(qū)域隨機(jī)掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外，采用自主設(shè)計(jì)可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光...

雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料，使其發(fā)出熒光。相比普通光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡運(yùn)用了波長更短的紫外線，再將可見光過濾掉，提高了分辨力率。而當(dāng)被檢物體過厚時(shí)，從不同深度發(fā)出的熒光都會打在物鏡上，使觀察到的像模糊、發(fā)虛，無法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu)。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問題。雙光子顯微鏡品牌有哪些？美國雙光子顯微鏡的原理細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)...

利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動(dòng)，隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，以此細(xì)胞的功能狀態(tài)。目前它被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，從而判斷其功能活動(dòng)。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時(shí)間和空間上的傳遞穿梭。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細(xì)胞進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)；國內(nèi)2PPLUS雙光子顯微鏡最大分辨率雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因...

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時(shí)刻只有一個(gè)點(diǎn)被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個(gè)時(shí)刻，只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號被探測。通過點(diǎn)掃描的方式，一個(gè)個(gè)點(diǎn)的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長，只有當(dāng)兩個(gè)（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時(shí)轟擊熒光探針的時(shí)候才可能激發(fā)出熒光信...

研究人員通過用不同激光波長并行化激光掃描（wavelengthmultiplexing），增加了相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積，并同時(shí)保持較高的時(shí)間和空間分辨率。通過引入兩種波長不同的鈣信號熒光探針，研究人員將神經(jīng)元群體的活動(dòng)標(biāo)記為兩個(gè)不同顏色，并同時(shí)用兩個(gè)不同波長的激光激發(fā)探針，實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)顏色的并行化數(shù)據(jù)記錄。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像，研究人員還分別在兩個(gè)激光光路上配置了快速變焦系統(tǒng)，分別為電可調(diào)節(jié)透鏡（electricaltunablelens）和空間光調(diào)制器（spatiallightmodulator）。由此，可以同時(shí)以10赫茲的速度記錄500微米500微米的10個(gè)平面，覆蓋縱深達(dá)600微米，涵蓋...

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強(qiáng)度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)...

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長波長的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測效率。雙光子...

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動(dòng)態(tài)后，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實(shí)驗(yàn)室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強(qiáng)大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場達(dá)到5毫米，能夠跨多個(gè)腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像。根據(jù)清華大學(xué)單一采購來源的專家指導(dǎo)意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍。30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計(jì)了自1990年以來每年發(fā)表的多...

由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度，在我們的實(shí)驗(yàn)中，時(shí)間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制。盡管在單點(diǎn)掃描系統(tǒng)中，v2PE激發(fā)會使得空間分辨率提高，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率，這主要是多聚焦成像和單點(diǎn)掃描技術(shù)之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE，引入圖像掃描技術(shù)可以進(jìn)一步提高空間分辨率，這種技術(shù)需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實(shí)現(xiàn)。除此之外，由于可見光區(qū)域的共振效應(yīng)，可能會產(chǎn)生光漂白，因而為了延長觀察時(shí)間，系統(tǒng)還需要對激發(fā)強(qiáng)度和曝光時(shí)間做進(jìn)一步優(yōu)化。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。進(jìn)口ulti...

相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、***觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強(qiáng)，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對細(xì)胞的毒性。除此之外，因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡。美國激光熒光雙光子顯微鏡廠家電話雙光子技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具...

指示劑是如何負(fù)載細(xì)胞，目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法，且都可以用于體內(nèi)和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個(gè)神經(jīng)元中。此方法方便實(shí)驗(yàn)者控制單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負(fù)載神經(jīng)元，觀察對象為一群神經(jīng)元。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細(xì)胞也被指示劑所標(biāo)記，但明顯提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動(dòng)作電位相關(guān)性的活動(dòng)。第三種也較為常用，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。（A）單細(xì)胞注射法；（B）networkloading法；（C）通過病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼...

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，還有一些短波長可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡光刺激細(xì)胞內(nèi)鈣離...

在國家自然科學(xué)基金委國家重大科研儀器研制專項(xiàng)《超高時(shí)空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動(dòng)態(tài)成像中心、生命科學(xué)學(xué)院、工學(xué)院聯(lián)合中國人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)清晰、穩(wěn)定的圖像。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊Nature Methods (IF 25.3)，相關(guān)技術(shù)文檔同步發(fā)表于Protocol Exchange (DOI: 10.1038/protex.2017.048)，并已申請多項(xiàng)。雙光子顯微鏡知多少。ul...

利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動(dòng)，隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，以此細(xì)胞的功能狀態(tài)。目前它被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，從而判斷其功能活動(dòng)。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時(shí)間和空間上的傳遞穿梭。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例；進(jìn)口ultimainvestigator雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍........

后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用碘化丙啶(PI)來指示細(xì)胞在7、8、9和10分鐘的延時(shí)觀察后的損傷情況，來驗(yàn)證該光學(xué)系統(tǒng)對活細(xì)胞長期觀察的適用性。在觀察期間，88個(gè)焦點(diǎn)以100毫秒的曝光時(shí)間，曝光間隔1s照射樣品，激發(fā)強(qiáng)度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長為525nm，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s，得到相應(yīng)的(i)-(p)。由圖像可知，延時(shí)觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細(xì)胞損傷，對于實(shí)際3D延時(shí)成像，由于焦平面是移動(dòng)的，所以預(yù)期細(xì)胞存活時(shí)間會更長，可見這是一種在3D在體延時(shí)成像中具有很...

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長波長的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測效率。在深度...

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強(qiáng)度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器...

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)個(gè)細(xì)胞興奮時(shí)，產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng)，此時(shí)，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng)。以此類推，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)...

要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫，這樣即能達(dá)到雙光...

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)個(gè)細(xì)胞興奮時(shí)，產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng)，此時(shí)，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng)。以此類推，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)...